孫 健 王 炎 王國(guó)娟 李 琦

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 （上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所），上海200062

中國(guó)是鼻咽癌（nasopharynegeal carcinoma，NPC）高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占全世界80%以上[1]。目前，鼻咽癌的治療以放射治療為主，但5年生存率僅50%左右，因此，尋找有效的治療手段和藥物是鼻咽癌研究的熱點(diǎn)[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是由我國(guó)首先合成的一種抗腫瘤藥物，是一種中藥單體，目前已應(yīng)用在多種腫瘤的實(shí)驗(yàn)和臨床治療研究[3]。目前，有關(guān)NCTD治療鼻咽癌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者研究了NCTD對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1增殖和凋亡的影響，為NCTD臨床治療鼻咽癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

去甲斑蝥素（山東平原制藥廠，H37023401）。RPMI 1640培養(yǎng)液（GIBCO公司）；人鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1）（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），37℃恒溫，5% CO2密閉傳代培養(yǎng)；PI染料（Sigma公司）；凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司）。

1.2 方法

NCTD溶解于1640培養(yǎng)液，過(guò)濾后除菌，配制成100 mmol/L NCTD母液。用10%小牛血清的1640培養(yǎng)液將NCTD母液稀釋成 10、20、40、60、80、100μmol/L 的工作液。

1.2.1 MTT比色法檢測(cè)CNE1細(xì)胞的增殖 胰蛋白酶消化CNE1細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后，隨機(jī)分為 7組，分別加入含0、10、20、40、60、80、100μmol/L的 NCTD 培養(yǎng)液，以 0μmol/L的 NCTD 為對(duì)照組。按NCTD的作用時(shí)間，24、48、72 h分別進(jìn)行MTT檢測(cè)。稱(chēng)取0.005 g MTT干粉，加入10 mL無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)液中，過(guò)濾除菌，配成MTT工作液。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100μL MTT工作液，培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩器加速結(jié)晶紫溶解，570 nm酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，所有孔吸光度值都減去空白孔吸光度值處理。細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔）/對(duì)照孔×100%，根據(jù)抑制率作出NCTD作用曲線并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 胰蛋白酶消化CNE1細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別加入0、10、20、40μmol/L濃度的NCTD，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后，消化并搜集細(xì)胞，PBS清洗2次。凋亡采用BD公司Annexin V ：FITC Apoptosis Detection Kit I試劑盒，處理方法參考相關(guān)說(shuō)明書(shū)。采用FACScaliub流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)， 每次計(jì)細(xì)胞數(shù)20 000個(gè)，分析軟件Cell Quest計(jì)算凋亡率。檢測(cè)細(xì)胞周期需在PBS液清洗兩次后加入200μL固定液（2%小牛血清，70%乙醇，28%PBS）4℃固定1 h，PBS清洗2次，加入PI（終濃度50μg/mL）和無(wú)DNA酶污染的RNA酶（終濃度50μg/mL）500μL染色1 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，ModFIT LT 2.0軟件分析細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以（± s）表示。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間進(jìn)行方差分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況

NCTD作用CNE1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，這一抑制作用隨NCTD濃度的升高而升高。圖1為NCTD作用48 h后CNE細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。隨著NCTD濃度升高，CNE1細(xì)胞數(shù)明顯減少，并呈現(xiàn)皺縮、凋亡。

圖1 NCTD作用48 h后CNE1細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.2 MTT檢測(cè)CNE1細(xì)胞增殖

不同濃度的NCTD作用細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，這一抑制作用隨NCTD濃度的變化而變化，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且濃度和時(shí)間與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴(lài)效應(yīng)（表1），NCTD對(duì)CNE細(xì)胞的IC50值24、48、72 h 分別為 86.5、40.8、28.2μmol/L。

表1 不同濃度NCTD作用于CNE細(xì)胞不同時(shí)間的抑制率（x ± s，%）

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

不同濃度的NCTD作用細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制并出現(xiàn)凋亡，凋亡率隨著NCTD濃度的變化而變化，各加藥組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 48 h不同濃度NCTD作用組 CNE細(xì)胞的凋亡比例（x ± s，%）

2.4 細(xì)胞周期分析

不同濃度的NCTD作用細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)周期發(fā)生改變，G2期細(xì)胞明顯增多，G2期細(xì)胞比例隨著NCTD濃度的變化而變化，各加藥組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 48 h不同濃度NCTD作用 CNE細(xì)胞后各期細(xì)胞比例變化（ ± s，%）

表3 48 h不同濃度NCTD作用 CNE細(xì)胞后各期細(xì)胞比例變化（ ± s，%）

NCTD濃度（μmol/L） G0/G1期 P S期 G2期 P 0 63.7±2.19 - 30.29±0.88 5.38±1.06 -10 68.55±1.26 ＜0.01 12.61±1.12 18.63±1.45 ＜0.01 20 66.15±1.43 ＜0.01 13.55±0.64 20.52±1.38 ＜0.01 40 56.56±2.22 ＜0.01 2.05±1.68 42.59±3.19 ＜0.01

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種主動(dòng)、程序化生理過(guò)程，它的發(fā)生受到環(huán)境刺激、生理和病理等因素的調(diào)控。該過(guò)程的正常或紊亂與機(jī)體進(jìn)行新陳代謝、保持自身相對(duì)穩(wěn)定以及腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)[4]。目前，很多藥物和治療手段都與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。NCTD是由我國(guó)上世紀(jì)80年代在研究斑蟊素的基礎(chǔ)上首先合成的一種抗腫瘤藥物，它可以抑制腫瘤細(xì)胞的DNA及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)其凋亡。目前，NCTD主要用于消化系統(tǒng)腫瘤，尤其是肝癌的治療。由于其副作用小，無(wú)腎毒性和骨髓毒性，是一種具有很大潛在應(yīng)用價(jià)值的抗癌藥物[5-8]。本研究結(jié)果顯示，NCTD對(duì)體外培養(yǎng)的CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，能夠誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G2期，抑制細(xì)胞分裂，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。

由于鼻咽癌惡性程度較高，早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且由于放化療等治療手段對(duì)患者身體有極大的損害，導(dǎo)致鼻咽癌患者的5年生存率較低[2]。近年來(lái)，中藥復(fù)方和中藥單體治療鼻咽癌的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)出來(lái)[9-10]。中藥在改善癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等方面具有優(yōu)勢(shì)[11]。NCTD作為一種中藥單體，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，在其他腫瘤臨床上的運(yùn)用預(yù)示著NCTD作為抗腫瘤藥物用于治療鼻咽癌的潛在價(jià)值。

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