謝華健，周小敏，林奇棟

（儋州市第一人民醫(yī)院，海南 儋州 571700）

支氣管哮喘(簡稱“哮喘”)是一種由多因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應性疾病，其中以氣道炎癥為最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應性的程度[1]。輔助性T細胞(Th細胞)及其產(chǎn)生的細胞因子在哮喘慢性氣道炎癥中起主要作用[2]，同時有研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細胞對于維持自身免疫耐受，抑制自身免疫性疾病具有重要作用[3-4]。本文以52例急性哮喘患者和56例慢性哮喘患者為研究對象，采用流式細胞術(shù)檢測哮喘患者外周血中Th1、Th2和CD4+CD25+T細胞的水平，觀察Th1/Th2細胞平衡的變化，并選擇60名健康人群作為對照，探討Th細胞和CD4+CD25+T細胞與哮喘發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選自2008年1月至2010年1月在我院門診和住院治療的哮喘患者，診斷及病情嚴重程度分類均符合中華醫(yī)學會呼吸病分會哮喘學組制定的哮喘診斷標準[5]。所有哮喘患者均仔細詢問病史及嚴格體檢，必要時檢查X線胸片排除肺炎。108例哮喘患者中，急性哮喘患者52例(急性組)，男29例，女23例，年齡18～63歲，平均 (46.2 ±12.6)歲；慢性哮喘患者56例(慢性組)，男32例，女24例，年齡21～66歲，平均(49.5±16.3)歲；60名健康對照人群(對照組)均來自同期我院健康體檢中心體檢，男34例，女26例，年齡20～60歲，平均 (39.7 ±14.8)歲。所有對象均排除腦外傷、腦腫瘤、腦血管疾病、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)疾病，各組的年齡差異和性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和儀器 鼠抗人單克隆抗體(mAb)CD3-FITC、CD8-PercP、IFN-γ-PE、IL-4-PE、CD4-PercP、CD25-PE及其相應同型對照IgG1-PE、IgG2a-PE和FACS Calibur流式細胞儀均為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)以及布雷菲德菌素A(BFA)購自美國Sigma公司。

1.2.2 Th1、Th2細胞測定 安靜狀態(tài)下無菌抽取研究對象空腹靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝，取400 μl平均分為刺激管及未刺激管，前者加入PMA(1 mg/L)、Ionomycin(50 mg/L)及 BFA(0.5 g/L)，后者僅加入BFA?；靹蚝蠹舆M細胞培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。收集細胞，分為對照管和試驗管，分別加入mAbCD3-FITC及CD8-PercP各20 μl進行胞膜表面標記染色，室溫避光孵育15 min，固定洗滌細胞進行破膜及胞內(nèi)因子標記，每管中加入100 μl破膜劑及相應的細胞內(nèi)因子mAb IFN-γ-PE、IL-4-PE和相應陰性對照IgG1-PE、IgG2a-PE各20 μl，室溫避光15 min。洗滌并加500 μl PBS重懸細胞，上機檢測。

1.2.3 CD4+CD25+T細胞檢測 安靜狀態(tài)下無菌抽取研究對象空腹靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝，分別向檢測管和同型對照管中加入外周血100 μl，檢測管加入mAbCD4-PercP及CD25-PE各20 μl，同型對照管加入同型對照鼠抗人IgG1/PE及IgG2a/PE標記抗體各20 μl，混勻，室溫避光孵育15 min后，每管各加紅細胞裂解液3 ml，振蕩混勻后置室溫孵育15 min，至液體透亮，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl磷酸緩沖液(PBS)重懸細胞，室溫避光10 min后上機檢測。

1.2.4 檢測分析細胞 用同型對照確定熒光陰性范圍，設定相應各信道電壓及之間的熒光補償后，依次使用流式細胞儀檢測標本，根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)對淋巴細胞群進行設門，每次獲取設門內(nèi)10 000個細胞，用CellQuest軟件獲取并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示。采用單因素的方差分析對各組外周血中Th1、Th2水平、Th1/Th2比值和CD4+CD25+細胞的水平進行比較，在此基礎上進行組間兩兩比較(LSD法)，上述分析均采用雙側(cè)檢驗，以α=0.05為統(tǒng)計意義水準。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值 由表1可知，各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組間兩兩比較(表2)顯示：急性組患者外周血中Th1水平顯著低于慢性組患者和健康對照人群(P＜0.05)，同時慢性組患者與健康對照人群的差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；急性組患者外周血中Th2水平顯著高于慢性組患者和健康對照人群(P＜0.05)，同時慢性組患者與健康對照人群的差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；急性組患者外周血中Th1/Th2比值顯著低于慢性組患者和健康對照人群(P＜0.05)，同時慢性組患者與健康對照人群的差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組外周血中CD4+CD25+細胞的水平 由表3可知，各組外周血中CD4+CD25+細胞的水平差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組間兩兩比較(表4)顯示：急性組患者外周血中CD4+CD25+細胞的水平顯著低于慢性組患者和健康對照人群(P＜0.05)，同時慢性組患者與健康對照人群的差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值（±s）

表1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值（±s）

組別 例數(shù)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2急性組慢性組對照組FP 52 56 60 10.216 0.000 11.62±4.52 13.36±4.34 15.11±3.40 10.216 0.000 3.88±1.32 3.07±0.84 2.46±0.58 31.617 0.000 4.29±1.50 3.07±1.57 7.97±.67 23.333 0.000

表2 外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值組間兩兩比較結(jié)果

表3 各組外周血中CD4+CD25+細胞的水平（%，±s）

表3 各組外周血中CD4+CD25+細胞的水平（%，±s）

組別急性組慢性組對照組FP例數(shù)52 56 60 CD4+CD25+4.29±1.50 6.56±1.57 7.97±1.67 75.909 0.000

表4 外周血中CD4+CD25+細胞的水平組間兩兩比較結(jié)果（±s）

表4 外周血中CD4+CD25+細胞的水平組間兩兩比較結(jié)果（±s）

組間比較急性組：慢性組急性組：對照組慢性組：對照組CD4+CD25+0.000 0.000 0.000

3 討論

哮喘的病因和發(fā)病機制非常復雜，在其氣道慢性變應性炎癥中，有多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子參與炎癥過程，T淋巴細胞及其分泌的各種細胞因子在其中發(fā)揮了重要作用。隨著研究的進展，Th細胞對哮喘的作用越來越受到重視，成為可能揭示哮喘發(fā)病機制的一個新的途徑[6]。Th細胞根據(jù)其分泌的細胞因子不同，主要分為Th1和Th2亞群。Th1細胞分泌IL-2和IFN-γ等細胞因子，可活化吞噬細胞，增強其抗感染能力，介導細胞免疫，同時可抑制過度的Th2細胞介導的免疫反應；Th2主要分泌IL-4，而IL-4可促進B細胞分化，誘導B細胞合成IgE，介導體液免疫反應。因此，Th2淋巴細胞在哮喘發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。過敏原對哮喘患者Th細胞增殖有選擇性，促進Th2細胞優(yōu)勢表達，從而使Th1/Th2平衡向Th2轉(zhuǎn)化[7]。當Th2細胞占優(yōu)勢時，IL-4分泌增加，易發(fā)生高IgE血癥，結(jié)果導致哮喘的發(fā)作。本研究結(jié)果顯示：與健康對照人群組比較，急性哮喘患者外周血中的Th1細胞明顯降低，而Th2細胞數(shù)明顯升高，且Th1/Th2比值明顯下降，說明哮喘患者Th亞群之間的平衡發(fā)生了改變，引起Th1細胞相對減少而Th2細胞相對增加，Th細胞亞群之間的相互抑制交叉調(diào)節(jié)的功能被削弱，由此可以推測Th細胞亞群之間的平衡破壞是哮喘發(fā)病中的重要因素。

2004 年Wickelgren從人的血液中分離到了CD4+CD25+T細胞，并證實其對其他T細胞的增殖具有抑制作用[8]。近年研究表明，CD4+CD25+T細胞在維持機體自身穩(wěn)定性及免疫耐受方面具有重要作用。在體外用抗原刺激后，人類CD4+CD25+T細胞可以抑制CD4+CD25+T細胞增殖和Th2型細胞因子的產(chǎn)生[9]。CD4+CD25+T細胞免疫功能可能是抑制Th2細胞對環(huán)境抗原的不適當應答，所以哮喘等過敏性疾病的發(fā)生機制可能就是此種調(diào)節(jié)功能的缺陷或者不足。本研究結(jié)果顯示：急性組患者外周血中CD4+CD25+細胞的水平顯著低于慢性組患者和健康對照人群。說明CD4+CD25+細胞數(shù)目的明顯減少，導致抑制Th2細胞的能力下降，Th2型細胞因子的產(chǎn)生增加，使哮喘發(fā)病。但是也有研究提示哮喘患者的CD4+CD25+T細胞在數(shù)量上無明顯減少，但在功能上存在缺陷[10]。

綜上所述，哮喘患者中Th細胞和CD4+CD25+T細胞出現(xiàn)明顯的數(shù)目變化，使某些細胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5)的分泌增加，從而介導細胞和體液免疫，導致哮喘的發(fā)生。因此Th1和Th2細胞的平衡破壞、CD4+CD25+T細胞數(shù)目和功能的下降在哮喘的疾病活動中起到重要的作用，是導致哮喘患者細胞免疫失調(diào)的重要原因。

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