黃 薇，姚清華，陳麗華，宋永康，黃敏敏，李玥仁1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室;福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003

真菌病害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。近年來(lái)，隨著分子植物病理學(xué)和植物基因工程的迅速發(fā)展，利用DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源抗真菌基因?qū)胨?，培育出抗病水稻新品種，成為解決這一問(wèn)題的有效途徑(張志忠等，2005;宋冬明等，2010)。在眾多外源抗真菌基因中，具有非特異性的廣譜抗真菌蛋白基因因其具有抗性譜寬、可在多種植物中表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，而倍受研究者的重視。

廣譜抗真菌蛋白基因在植物組織中的組成型高水平表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻獲得了較高的抗病水平和較寬的抗性譜，但同時(shí)也可能造成潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。此外，真菌在植株木質(zhì)素的降解中起著主要的作用，組成型高水平表達(dá)的廣譜抗真菌蛋白有可能抑制真菌對(duì)水稻秸稈木質(zhì)素的降解(郁紅艷等，2003)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因食品安全評(píng)估中的實(shí)質(zhì)等同原則(劉曉云和何小維，2005)，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中化學(xué)成分的變化進(jìn)行分析，同時(shí)利用電子顯微鏡觀察水稻品種的組織顯微結(jié)構(gòu)，以期為進(jìn)一步研究廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的降解效率以及環(huán)境安全性評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌呓z軟粘。轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8由中山大學(xué)和廣東海洋大學(xué)聯(lián)合選育，是利用基因槍法將2～3個(gè)廣譜抗真菌蛋白基因以及標(biāo)記基因hpt導(dǎo)入秈稻品種“七絲軟粘”中，經(jīng)過(guò)選育獲得的對(duì)稻瘟病Magnaporthe grisea(Hebert)Barr和紋枯病菌Rhizoctonia solani Kühn抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因水稻(馮道榮等，1999)。其中，轉(zhuǎn)品1為三價(jià)抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24、RCH10)和水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因(RAC22);轉(zhuǎn)品8為雙價(jià)抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)入目的基因?yàn)樗緣A性幾丁質(zhì)酶基因(RC24)和苜蓿葡聚糖酶基因(β-1，3-Glu);啟動(dòng)子為在水稻中高效表達(dá)的Act1。

1.2 方法

1.2.1 供試水稻的栽培方法 于2008年3月17日在福建省福州市閩侯縣良種場(chǎng)種植供試水稻。供試地貌為閩江兩岸丘陵河谷區(qū)，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。選擇水肥條件一致的隔離試驗(yàn)水田，試驗(yàn)水田為梯田形式，面積約為500 m2，分為9個(gè)試驗(yàn)小區(qū)。水田土壤為黃紅壤，總碳含量 16.44 g·kg－1，總氮 1.15 g·kg－1，有效磷 33.31 mg·kg－1，速效鉀68.97mg·kg－1，pH 5.56。田間水肥、栽培技術(shù)管理按當(dāng)?shù)卦耘嗨綄?shí)施，每個(gè)品種種植3個(gè)重復(fù)小區(qū)。水稻測(cè)試樣品均以多點(diǎn)隨機(jī)的方法分別于分蘗期、孕穗期、抽穗期、灌漿期、成熟期進(jìn)行采樣。將采回的樣品葉片、葉鞘和莖分開(kāi)，在105℃下殺青15 min，然后在80℃烘24 h，粉碎后過(guò)60目篩，裝入樣品袋存放于干燥器內(nèi)，以備分析待用。

1.2.2 化學(xué)成分測(cè)定 秸稈化學(xué)成分含量以干物質(zhì)為比較基礎(chǔ)，依據(jù)van Soest et al.(1991)的方法，采用FOSS纖維浸提器測(cè)定秸稈各植物學(xué)部位(葉片、葉鞘、莖)半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量。依據(jù)GB/T 6432-1994，采用FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定秸稈葉片、葉鞘、莖的粗蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 組織顯微結(jié)構(gòu)觀察 取成熟期水稻，經(jīng)液氮干燥后，將葉片上表皮和莖稈橫斷面固定在樣品銅臺(tái)上，真空離子濺射儀噴金包埋，于日本電子JSM-6380LU掃描電鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理，對(duì)不同生育期各水稻品種的化學(xué)組分采用SPSS軟件包中的方差分析過(guò)程(ANOVA)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻纖維素含量分析

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在不同生育期葉片、葉鞘和莖的纖維素含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。從圖中可知，七絲軟粘葉片、葉鞘和莖的纖維素含量在不同生育期內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的變化，且各部位的變化趨勢(shì)大致相似，即從分蘗期至孕穗期逐漸下降，至抽穗期逐漸增加，至灌漿期逐漸下降，種子灌漿后纖維化程度增加。轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的變化趨勢(shì)與七絲軟粘一致，且含量差異均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

2.2 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻半纖維素含量分析

圖2顯示為廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8以及相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在不同生育期葉片、葉鞘和莖半纖維素含量的變化趨勢(shì)。從圖中可以看出，供試水稻品種的葉片、葉鞘和莖的半纖維素含量變化趨勢(shì)基本一致;且除個(gè)別情況外，不同生育期品種間各個(gè)部位半纖維素含量的差異不顯著(P＞0.05)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，供試品種半纖維素的動(dòng)態(tài)變化與纖維素成負(fù)相關(guān)，當(dāng)纖維素含量增加時(shí)，半纖維素含量下降。由此可見(jiàn)，水稻植株生理上具有一定程度的自主調(diào)節(jié)能力，纖維素與半纖維素的協(xié)同作用，能夠維持對(duì)植物體的機(jī)械支撐。此現(xiàn)象同 Wang et al.(2006)和沈恒勝等(2004)的研究結(jié)果基本吻合。

圖1 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中纖維素含量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in cellulose content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

圖2 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中半纖維素含量動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in hemi-cellulose content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

2.3 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻木質(zhì)素含量分析

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在進(jìn)入抽穗期后，其葉片、葉鞘和莖的木質(zhì)素含量均有不同程度的上升趨勢(shì)，且各個(gè)生育期木質(zhì)素含量都表現(xiàn)為葉片、葉鞘＞莖(圖3)。沈恒勝等(2001)認(rèn)為，稻草中木質(zhì)素含量同硅化物的含量具有顯著相關(guān)性，而水稻硅化物分布又具有隨生長(zhǎng)發(fā)育向外、向上傳輸?shù)奶匦裕氏鄬?duì)于葉片和葉鞘，莖的木質(zhì)素含量較低。

木質(zhì)素的降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果，其中真菌起主要作用。分析結(jié)果表明，除孕穗期的葉鞘及成熟期的莖外，供試廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻各部位的木質(zhì)素含量與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻相比均不存在顯著差異(P＞0.05)。由此可推測(cè)，廣譜抗真菌蛋白基因的導(dǎo)入對(duì)秸稈木質(zhì)素的含量和分布沒(méi)有較大的影響。

2.4 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻粗蛋白質(zhì)含量分析

從圖4可知，七絲軟粘葉片、葉鞘和莖的粗蛋白質(zhì)含量均在分蘗期最高，分別為23.4%、10.4%和17.1%;之后逐步下降，成熟期達(dá)到最低，分別為11.8%、5.8%和 3.0%。轉(zhuǎn)品 1、轉(zhuǎn)品 8 與七絲軟粘的葉片、葉鞘和莖粗蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致。水稻在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程中都需要大量的蛋白質(zhì)來(lái)滿足細(xì)胞組織的更新和修補(bǔ)，這可能是導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量持續(xù)降低的原因。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與七絲軟粘的蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P＞0.05)。這在一定程度上反映了廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因品種具有相似性。

圖3 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素含量動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in lignin content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

圖4 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中粗蛋白質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of crude protein content during the growth and development in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins plants at different growth stages

2.5 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

供試水稻品種的葉片表面均含有許多大小不一的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)，這些硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)分布在葉片不同的部位，包括氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞上(圖5A～C)。分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及七絲軟粘的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)排列形狀變化趨向一致，致密程度無(wú)明顯差異。此外，各品種間葉表皮的氣孔排列致密程度接近，每個(gè)氣孔周圍均分布了4～8個(gè)呈簇狀排列、尖端向心性的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)。

用掃描電鏡觀察莖稈組織(圖5D～F)顯示，廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻莖稈的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相似，莖壁、厚壁組織、薄壁組織以及維管束等結(jié)構(gòu)的形態(tài)和所占面積比例基本一致，大、小維管束的數(shù)目、分布密度及面積大小等也無(wú)明顯差異，且各水稻品種莖稈的薄壁組織細(xì)胞中均貯藏著豐富的木質(zhì)素以及淀粉等多糖顆粒。由此可見(jiàn)，廣譜抗真菌基因的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻的組織形態(tài)沒(méi)有影響。

圖5 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏慕M織顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 The microstructure of leaf and stem tissue of transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins plants and its nontransgenic counterpart under scanning electron microscope(SEM)

3 討論

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻盡管對(duì)真菌病害具有明顯抗性，可以大幅度提高水稻產(chǎn)量，但人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全性及其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響存在疑慮。將轉(zhuǎn)基因作物及來(lái)源的食品與非轉(zhuǎn)基因同源對(duì)照物在表型、農(nóng)藝性狀、組成成分等方面進(jìn)行詳細(xì)的比較，從而得出轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因同源對(duì)照物是否具有實(shí)質(zhì)等同性結(jié)論的工作被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的重要起始點(diǎn)(賀曉云等，2008)。李英華等(2004)對(duì)轉(zhuǎn)入抗水稻白葉枯病Xanthomonas oryzae pv.oryzae Dye Xa21基因的轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻種植條件完全相同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)差異。Han et al.(2005)對(duì)轉(zhuǎn)入豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的水稻及其親本的主要營(yíng)養(yǎng)成分(水分、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、碳水化合物、纖維、灰分、各類脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等)進(jìn)行了詳細(xì)的分析和比較，結(jié)果顯示除脂肪和脂肪酸有細(xì)微的區(qū)別外，其他成分均無(wú)差異。Li et al.(2007)同樣對(duì)轉(zhuǎn)sck和cry1AC基因的抗蟲(chóng)水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行了細(xì)致的營(yíng)養(yǎng)成分等同性分析，結(jié)果認(rèn)為轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照在主要營(yíng)養(yǎng)成分上具有實(shí)質(zhì)等同性。但是，這些分析采用的都是稻米的數(shù)據(jù)，僅強(qiáng)調(diào)了食用安全的評(píng)價(jià)，而忽視了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)環(huán)境的安全性評(píng)價(jià)。

本研究對(duì)廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8及其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各植物學(xué)部位(葉片、葉鞘、莖)的主要化學(xué)成分，包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素以及粗蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果顯示，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8各植物學(xué)部位的化學(xué)成分含量變化趨勢(shì)與對(duì)照七絲軟粘基本一致。水稻葉面的“硅質(zhì)化”特殊結(jié)構(gòu)以及莖稈的粗細(xì)，大、小維管束數(shù)目和莖壁厚度等物理特性都已被證明與水稻抵抗病菌和害蟲(chóng)侵害的能力有著密切的關(guān)系(楊秉耀等，2006;Belanger et al.，1995;Fidanza＆ Dernoeden，1996;張上都等，2010)。故本研究利用掃描電鏡觀察了成熟期轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及對(duì)照七絲軟粘的組織顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，與其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻基本一致。因此，認(rèn)為廣譜抗真菌幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因的導(dǎo)入未引起水稻植株化學(xué)成分組成和組織顯微結(jié)構(gòu)的明顯變化。據(jù)報(bào)道，秸稈的化學(xué)成分組成與秸稈的降解消化有密切的相關(guān)性(Keys＆DeBarthe，1974)。

轉(zhuǎn)基因水稻安全性評(píng)價(jià)工作是復(fù)雜的系統(tǒng)性工程。本研究?jī)H是轉(zhuǎn)基因水稻環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的起步，有關(guān)其食用安全性以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等還有待于進(jìn)一步探索試驗(yàn)。

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