賀俊英，朱云枝，宋小玲，強 勝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，江蘇南京0095;內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特000

ATP酶廣泛分布于生物有機(jī)體內(nèi)，它同各種膜體系和細(xì)胞器有著密切的聯(lián)系，是質(zhì)膜的束縛酶，且與植物細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)吸收和運輸?shù)冗^程有關(guān) (Arango et al.，2003;Serrano，1989;Luan，2003);ATP酶也參與幾乎所有生命體系的能量轉(zhuǎn)換過程，因而其活性定位被認(rèn)為是研究細(xì)胞功能和生理代謝狀態(tài)的重要手段(Hall et al.，1982;Zhang et al.，2006)。ATP酶還與植物對溫度(高溫和低溫)、鹽、重金屬、除草劑、CO2、O3、水分脅迫等逆境的生理反應(yīng)密切相關(guān)，說明ATP酶可能直接參與植物的抗逆反應(yīng)生理過程(周瑞蓮和王海鷗，1999;馬新明等，2006;潘秋紅等，2007;柯文山等，2007;郭丹等，2007;趙志磊等，2007;李雪梅等，2008;韓建秋，2010)。近年來，有關(guān)ATP酶活性和耐熱性的研究逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注。一些研究表明，不同植物在高溫脅迫下，ATP酶呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。如花生Arachis hypogaea L.幼苗ATP酶先升后降(宰學(xué)明等，2007);水稻Oryza sativa L.耐熱型品種根系質(zhì)膜ATP酶活性升高，熱敏感型品種活性降低(石慶華等，2006);高溫誘導(dǎo)豌豆Pisum sativum L.葉片質(zhì)膜H+-ATP酶升高，并可能在信號傳遞中起作用(潘秋紅等，2007);前期經(jīng)低溫鍛煉，在高溫脅迫下葡萄Vitis vinifera L.的Ca2+-ATP酶活性明顯提高(Zhang et al.，2006)，另外，葡萄幼苗經(jīng)過38℃高溫鍛煉后，其葉片質(zhì)膜H+-ATP酶活性明顯增強(劉楊等，2009)。但是，通過ATP酶的細(xì)胞化學(xué)定位技術(shù)揭示外來入侵植物對高溫生態(tài)適應(yīng)性的研究尚未見報道。

紫莖澤蘭 Eupatorium adenophorum(Spreng.)屬菊科澤蘭屬，是一種世界性的惡性雜草，現(xiàn)已分布于我國的云南、四川、廣西、貴州和湖北等省(市)，造成其廣泛危害的重要原因之一就是其具有較強的入侵性，而入侵性與其生態(tài)適應(yīng)性相關(guān)。蘇秀紅等(2005)利用人工模擬法，對采自云南、廣西、四川和貴州等省18個地區(qū)的紫莖澤蘭種群進(jìn)行抗高溫比較，篩選出對高溫(40℃)有較強抗性的元江種群和較敏感的大理種群，并進(jìn)一步通過比較研究揭示了它們抗性生理指標(biāo)的差異。為了更直觀地比較研究種群間在抗熱性生理方面的差異，本文采用磷酸鉛沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)方法，以上述2個抗性差異最大的種群為材料，研究經(jīng)高溫脅迫后ATP酶的活性及定位，以揭示高溫抗性響應(yīng)在細(xì)胞學(xué)上的表現(xiàn)特征，進(jìn)而為闡明與紫莖澤蘭適應(yīng)性相關(guān)的入侵機(jī)理積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取對高溫有較強抗性的元江種群和較敏感的大理種群，將其種子播于口徑為10 cm的盆缽中，并置于培養(yǎng)室萌發(fā)(12D∶12L)，用保鮮膜保濕，待幼苗高度為1 cm左右時移入一次性口杯(土壤基質(zhì)為土∶草炭=3∶1)繼續(xù)生長，待幼苗生長至5～6對真葉時進(jìn)行高溫處理。

1.2 試驗設(shè)計

分別選取生長健壯、具有6對真葉且長勢相同的抗性、敏感種群幼苗置于X-Z智能人工氣候箱中進(jìn)行高溫處理，溫度為40℃，處理時間為0、6、12、24 h，濕度保持在80%。處理后分別取樣，取樣部位為從頂端開始的第2對葉片。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10株。以在培養(yǎng)室自然生長狀態(tài)下(溫度25℃、濕度80%)的幼苗為對照。

1.3 ATP酶定位試驗方法

試驗主要參照蘇金為和王湘平(2002)及田國偉和申家恒(1996)的方法。將所選葉片中部、葉脈兩側(cè)對稱部位，用雙面刀片切成1.5 mm×3.0 mm左右的長方形小塊，其長邊與葉脈的方向平行。立即投入用50 mmol·L－1二甲砷酸鈉緩沖液(pH 7.2)配制的2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液中于4℃下固定2 h。固定完成后，先用二甲砷酸鈉緩沖液沖洗2次，每次1 h，再用50 mmol·L－1Tris-順丁烯二酸緩沖液(pH 7.2)沖洗 2次，每次30 min。然后將材料轉(zhuǎn)移到修改的Wachstein-Meisel酶反應(yīng)液［50 mmol·L－1Tris-順丁烯二酸緩沖液(pH 7.2)中含 5'-ATP 2 mmol·L－1、硝酸鉛 3 mmol·L－1、MgSO45 mmol·L－1］中，在 22 ℃ 恒溫條件下孵育2 h。為了防止假陽性，每個處理均設(shè)對照:(1)反應(yīng)液中不加5'-ATP;(2)反應(yīng)液中加入10 mmol·L－1NaF抑制劑。酶反應(yīng)結(jié)束后，先用二甲砷酸鈉緩沖液清洗3次，每次15 min;再用該緩沖液配制的2%鋨酸固定液于4℃下固定過夜;然后用重蒸水清洗3次，每次1 h。再經(jīng)丙酮系列脫水，Epon 812包埋;LKB型超薄切片機(jī)切片，厚度500 nm;不經(jīng)染色直接在H-800型電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATP酶定位原理

ATP酶若分布在細(xì)胞中，遇到其底物和鉛即可產(chǎn)生磷酸鉛沉淀(正反應(yīng))，呈電子密度致密的點狀或線狀。本試驗觀察發(fā)現(xiàn)，所有不加酶底物和加入酶抑制劑的對照反應(yīng)中均未產(chǎn)生磷酸鉛的電子致密點(圖1A、B)，而正反應(yīng)中都有不同程度的磷酸鉛電子致密點分布，說明電子致密點是ATP酶的真實反應(yīng)。

2.2 抗性、敏感種群ATP酶細(xì)胞化學(xué)定位的差異

抗性、敏感種群未經(jīng)過40℃高溫處理的對照樣葉片中均有ATP酶的活性分布，主要定位于細(xì)胞壁，且二者之間的分布量沒有明顯的差異(圖1C、D)。葉綠體的結(jié)構(gòu)清晰完整。

經(jīng)過高溫處理6 h時，抗性、敏感種群ATP酶在細(xì)胞壁上的分布量均比對照稍多(圖1E、F)，但二者差異仍不太明顯，只是抗性種群的細(xì)胞膜上出現(xiàn)零星的分布(圖1E)。2個種群葉綠體的超微結(jié)構(gòu)也均正常。

經(jīng)過高溫處理12 h時，抗性種群ATP酶反應(yīng)強烈，在細(xì)胞壁上的分布大大增多，呈致密的線條狀，同時在細(xì)胞膜上也有大量分布(圖1G)，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)仍完整;此時敏感種群ATP酶反應(yīng)則很微弱，只在細(xì)胞壁上有少量的定位分布，比其對照和處理6 h時均減少(圖1H)，葉綠體基粒片層和基質(zhì)片層模糊化。

經(jīng)過高溫處理24 h時，抗性種群細(xì)胞膜上仍有ATP酶的活性定位點(圖1I)，細(xì)胞膜及葉綠體的基粒片層開始出現(xiàn)模糊的跡象(圖1J);但此時的敏感種群第2對葉片已萎蔫，故無法觀察超微結(jié)構(gòu)的定位。

3 結(jié)論與討論

3.1 紫莖澤蘭種群間ATP酶活性差異與高溫適應(yīng)能力關(guān)系的探討

在40℃高溫處理下，抗性差異最大的2個紫莖澤蘭種群葉片ATP酶活性反應(yīng)水平在起始狀態(tài)下一致;隨著處理時間的延長，抗性種群ATP酶的活性明顯加強，尤其在12 h時反應(yīng)最強烈，敏感種群則無明顯加強，12 h時酶活性反應(yīng)已十分微弱。這一現(xiàn)象與石慶華等(2006)對水稻的研究結(jié)果基本一致。有關(guān)植物中ATP酶活性發(fā)生變化的相關(guān)原理已有報道，認(rèn)為該酶與植物體內(nèi)的物質(zhì)離子吸收與運轉(zhuǎn)有關(guān)。如蘇金為和王湘平(2001)通過對茉莉Jasminum sambac(L.)幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，ATP酶的活性與物質(zhì)運輸密切相關(guān);王秀玲和高新起(2002)通過比較蕎麥Fagopyrum esculentum Moench.柱頭、花柱不同發(fā)育時期ATP酶的活性認(rèn)為，高的ATP酶活性表明物質(zhì)代謝和細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移活躍;田國偉和申家恒(1996)對小麥Triticum aestivum L.珠心細(xì)胞衰退過程中ATP酶的研究同樣得出，高的ATP酶活性表明細(xì)胞正進(jìn)行旺盛的主動物質(zhì)吸收。Serrano(1989)也認(rèn)為，ATP酶活性與植物體的物質(zhì)主動吸收及運輸成一定的正相關(guān)。本研究中，抗性種群隨高溫處理時間的延長ATP酶活性加強，這可能會在一定程度上促進(jìn)其體內(nèi)的物質(zhì)代謝和運輸，使其能對高溫表現(xiàn)出較強的忍耐性;而敏感種群ATP酶活性逐漸減弱，植株較早萎蔫，從而表現(xiàn)出對高溫的弱適應(yīng)性。此外，ATP酶在高溫脅迫下還可能參與了抗逆信號傳遞的過程，抗性種群比敏感種群更活躍地傳遞逆境信號，以便抵抗逆境的反應(yīng)(潘秋紅等，2007)。

3.2 紫莖澤蘭種群間ATP酶定位點不同與高溫適應(yīng)性差異的探討

經(jīng)高溫脅迫后，紫莖澤蘭抗性、敏感種群葉片的ATP酶活性表現(xiàn)不同、酶超微結(jié)構(gòu)的定位點也有明顯差異。敏感種群ATP酶只定位于細(xì)胞壁，細(xì)胞膜較早出現(xiàn)傷害;抗性種群則除細(xì)胞壁外，細(xì)胞膜上也分布了大量的ATP酶活性定位點，在處理24 h時仍保持一定的活性。

一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ATP酶主要分布在與物質(zhì)離子的吸收與運轉(zhuǎn)有關(guān)的組織細(xì)胞中，且其活性沉淀物大多沿著細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的位置分布定位(Arango et al.，2003;王秀玲和高新起，2002)。細(xì)胞膜ATP酶被認(rèn)為在物質(zhì)的吸收與運輸中起著質(zhì)子泵的作用，它的活動形成離子跨膜運輸?shù)脑瓌恿?Gunther ＆ Scherer，1984;Kasamo，2003;Serrano，1989;蘇金為和王湘平，2002)。本試驗中紫莖澤蘭抗性種群經(jīng)高溫處理后，ATP酶的定位點在細(xì)胞膜上不斷增加，12 h時最強烈，24 h時仍有分布，這可能會在一定程度上積極調(diào)動細(xì)胞膜與運輸有關(guān)的組織細(xì)胞來擔(dān)負(fù)物質(zhì)的正常運輸任務(wù);而敏感種群ATP酶定位點少，植株也較早受害，表現(xiàn)出對高溫的弱適應(yīng)性。

以上ATP酶的細(xì)胞化學(xué)定位研究反映了種群間適應(yīng)性的差異與ATP酶有一定的關(guān)系。

圖1 40℃高溫處理后紫莖澤蘭葉片的ATP酶定位Fig.1 ATPase distribution of E.adenophorum leaves after 40 ℃ high temperature

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