丁細(xì)桃，李軍偉，張立康，邱相君

胞磷膽堿為膽堿胞嘧啶核苷二磷酸酯，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)性磷脂生物合成過程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)。吸收后在體內(nèi)廣泛分布，并透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。通過降低腦血管阻力，增加腦血流而促進(jìn)腦物質(zhì)代謝，改善腦循環(huán)。對(duì)于認(rèn)知障礙、記憶缺失和早期阿爾茨海默病的病人有良好的臨床療效，對(duì)促進(jìn)大腦功能的恢復(fù)和促進(jìn)蘇醒有一定作用［1］，是目前治療卒中最為看好的神經(jīng)保護(hù)劑之一［2］。目前，胞磷膽堿已廣泛應(yīng)用于缺血性卒中、腦外傷和認(rèn)知障礙的治療，其在腦出血、帕金森病和青光眼等疾病中的治療應(yīng)用也日益受到重視［3］。

國內(nèi)關(guān)于血漿中胞磷膽堿檢測(cè)和藥代動(dòng)力學(xué)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)首先建立了檢測(cè)兔血漿胞磷膽堿濃度的高效液相色譜檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上研究了胞磷膽堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀為Agilent1100 系列，包括G1379A 在線脫氣機(jī)，G1311A 四元泵，G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A 溫控箱，G1315B 二極管陣列檢測(cè)器，和Agilent 化學(xué)工作站(Rev A.10.02.［1757］)。電子分析天平(AB204－A，梅特勒－托利多上海儀器公司);渦旋混合器(XK96－B，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);高速冷凍離心機(jī)(TGL－16，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試劑和藥品 甲醇和乙腈為一級(jí)色譜純，三氟乙酸(Sigma，064K3647)，高氯酸為優(yōu)級(jí)純，十二烷基硫酸鈉(SDS)為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。胞磷膽堿(140675－200803)、安替比林標(biāo)準(zhǔn)品(100506－200301)均購自中國藥品生物制品檢定所。胞磷膽堿注射液(091010)，上海福達(dá)制藥有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 對(duì)照品配制 準(zhǔn)確稱取胞磷膽堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品25 mg 于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 mL，得濃度為1 g/L 的胞磷膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用甲醇稀釋成濃度依次為100、10、1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用時(shí)稀釋)。

1.3.2 0.1%三氟乙酸(TFA)溶液 準(zhǔn)確吸取三氟乙酸1 mL，用純凈水稀釋并定容至1 L;0.45 μm 濾膜過濾后使用。

1.3.3 10 mmol·L－1十二烷基磺酸鈉(SDS) 準(zhǔn)確稱取SDS 2.884 g，用純凈水溶解后，于1 000 mL 容量瓶中用純凈水定容，得濃度為10 mmol/L SDS 溶液。0.45 μm 濾膜過濾后使用。

1.4 色譜條件 色譜柱:Agilent TC－C18(4.6 ×150 mm，5.0 μm，USA);保護(hù)柱:TC－C18保護(hù)柱(4.6 ×12.5mm，5 μm，USA);流動(dòng)相:乙腈－水－ 10 mmol/L SDS－0. 1%TFA =10:50:20:20(V/V/V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長:282 nm。

1.5 血漿樣品處理方法 準(zhǔn)確吸取待測(cè)血漿樣品0.3 mL 于1.5 mL EP 管中，加入100 mg/L 安替比林內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液20 μL，再加入35%高氯酸30 μL，漩渦振蕩20 s 后，12 000 r/min 離心10 min。取上清液于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，設(shè)定5 μL 進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 6 只雄性家兔由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2.0 ～2.5 kg，禁食12 h后用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。胞磷膽堿注射液用純凈水稀釋成濃度為10 mg/mL。每只動(dòng)物按照10 mg/kg的劑量灌胃給予胞磷膽堿，2 h 后禁食不禁水。分別在給藥前和給藥后0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6 h 耳緣靜脈采血1.0 mL 于肝素化試管中。3 000 r/min 離心10 min 后分離血漿，－80℃保存待檢。用上述方法檢測(cè)血漿胞磷膽堿濃度，用DAS 2.0 程序計(jì)算姜黃素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 圖譜 血漿中胞磷膽堿峰形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾。胞磷膽堿保留時(shí)間為5. 2 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為6.5 min 。

2.2 線性關(guān)系及定量下限 配成濃度相當(dāng)于0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg/L 的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.5”項(xiàng)方法處理后檢測(cè)，測(cè)定胞磷膽堿峰面積As、內(nèi)標(biāo)峰面積Ai，以As/Ai為縱坐標(biāo)(y)，以所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。胞磷膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =0.2902x－0.0015(r =0.9998)。定量下限為0.25 mg/L(n=6，RSD=6.52%)。

2.3 回收率試驗(yàn)

2.3.1 相對(duì)回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行6 組，再按“1.5”項(xiàng)方法處理。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的濃度，計(jì)算相對(duì)回收率(結(jié)果見表1)。

表1 血漿胞磷膽堿的回收率結(jié)果(n=6，±s)

表1 血漿胞磷膽堿的回收率結(jié)果(n=6，±s)

加入量(mg/L) 檢測(cè)量(mg/L) 相對(duì)回收率(%) RSD(%) 絕對(duì)回收率(%) RSD(%)0.50 0.51 ±0.02 101.47 ±4.53 4.47 80.96 ±1.94 2.39 10.00 10.05 ±0.42 100.52 ±4.19 4.17 81.31 ±1.56 1.92 30.00 30.07 ±0.91 100.22 ±3.02 3.02 82.19 ±0.8 4 1.02

2.3.2 絕對(duì)回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行6 組，再按“1.5”項(xiàng)方法處理后測(cè)定，計(jì)算胞磷膽堿的峰面積，為血漿標(biāo)準(zhǔn)峰面積。另配制濃度為0.50、10.00、30.00 mg/L 的胞磷膽堿純標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直接5 μL 進(jìn)樣檢測(cè)，記錄胞磷膽堿的峰面積，為該濃度的純對(duì)照品的峰面積。計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積與純標(biāo)的峰面積的比值，即為絕對(duì)回收率(結(jié)果見表1)。

2.4 精密度試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行6 組，再按“1.5”項(xiàng)方法處理后于同一日內(nèi)測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d 內(nèi)測(cè)定，計(jì)算日間精密度(結(jié)果見表2)。

表2 血漿胞磷膽堿的精密度結(jié)果(n=6，±s)

表2 血漿胞磷膽堿的精密度結(jié)果(n=6，±s)

加入量(mg/L)日內(nèi)(mg/L)RSD(%)日間(mg/L)RSD(%)0.50 0.50 ±0.02 4.03 0.50 ±0.02 4.38 10.00 10.13 ±0.29 2.86 10.17 ±0.34 3.36 30.00 30.19 ±0.84 2.77 30.18 ±0.86 2.85

2.5 樣品穩(wěn)定性

2.5.1 凍融條件下血漿樣品的穩(wěn)定性 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度3 份。經(jīng)歷3 次冰凍－解凍循環(huán)后，各取0.3 mL 檢測(cè)。3 個(gè)濃度的RSD 分別為6.49%、5.28%、2.86%，結(jié)果顯示凍融條件對(duì)血漿樣品的檢測(cè)結(jié)果沒有明顯的影響。

2.5.2 冰凍保存血漿樣品的穩(wěn)定性 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度3 份，在－80℃冰箱冰凍保存4 周后，各取0.3 mL 檢測(cè)。3 個(gè)濃度的RSD 分別為7.03%、3.48%、1.54%，說明血漿樣品在冰凍保存的條件下有很好的穩(wěn)定性。

2.6 血藥濃度－時(shí)間曲線 6 只家兔按10 mg/kg的劑量灌胃給予胞磷膽堿后，用該HPLC 法測(cè)得不同時(shí)間胞磷膽堿平均藥物濃度－時(shí)間曲線見圖1。

2.7 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 血漿藥物濃度經(jīng)DAS 2.0程序處理，用房室模型估算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);根據(jù)F檢驗(yàn)、AIC 值和擬合優(yōu)度值R2，選擇最優(yōu)房室模型和權(quán)重，認(rèn)為該藥在家兔體內(nèi)符合一室模型，權(quán)重1/c2，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用DAS2.0 計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下結(jié)果見表3。胞磷膽堿在兔體內(nèi)符合一級(jí)消除的一室模型。

圖1 單劑量注射10 mg/kg 胞磷膽堿后的平均血漿藥－時(shí)曲線(n=6)

表3 6 只家兔單劑量注射10 mg/kg胞磷膽堿的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

胞磷膽堿的極性很強(qiáng)，易溶于水和甲醇。在反相C18 色譜柱中不易保留，在制劑和血漿檢測(cè)中，流動(dòng)相采用水相［4，5］，需要特殊的水相柱。本研究在流動(dòng)相中加入十二烷基磺酸鈉(SDS)使其保留時(shí)間延長，在流動(dòng)相中增加了有機(jī)成分，可以減少水相對(duì)色譜柱的損傷，普通色譜柱就能很好地出峰。采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法對(duì)血漿進(jìn)行前處理，處理方法簡單、專屬性高、分離完全、成本較低廉;檢測(cè)時(shí)間短，7.0 min 能完成一個(gè)樣品的檢測(cè)，特別適合大批量樣品的自動(dòng)化檢測(cè)工作;方法回收率高，日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于10%，符合藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。適于化學(xué)藥物分析和臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究，結(jié)果可靠。

胞磷膽堿是一種生物利用度超過90%的水溶性化合物。外源性胞磷膽堿進(jìn)入體內(nèi)后，很快分解為膽堿和胞苷，它們穿過血腦屏障，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重新合成胞磷膽堿［6］。在健康志愿者中，膽堿和胞苷水平在注射后30 min 達(dá)峰值，并且其循環(huán)濃度在此后6 h 持續(xù)增高?？诜啄憠A能被迅速而完全地吸收，在腸壁內(nèi)被水解為膽堿和胞苷，它們進(jìn)入各種利用胞磷膽堿作為介質(zhì)的生物合成通路，與靜脈注射胞磷膽堿具有相同的生物利用度和相似的藥代動(dòng)力學(xué)特征［6］。放射性示蹤劑研究表明，胞磷膽堿主要通過呼出CO2和尿液排泄，CO2和尿液消除的半衰期分別為51 h 和71 h［7］。大鼠口服給予胞磷膽堿后，血漿中膽堿和胞苷水平持續(xù)升高4 ～6 h。持續(xù)給予42 ～90 d 后，腦細(xì)胞膜3 個(gè)主要的磷脂—磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸升高［1］。

本研究先建立高效液相色譜法檢測(cè)兔血漿胞磷膽堿濃度，研究了胞磷膽堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果顯示:6 只雄性家兔單劑量口服給藥胞磷膽堿后，胞磷膽堿在1.08 h 到達(dá)18.79 mg/L 的峰值濃度，血漿消除半衰期為1.03 h;在兔體內(nèi)符合一級(jí)消除的一室模型，與靜脈給藥的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本一致［5］

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