李世軍 秦衛(wèi)松 張明超 鄭春霞 左 科 陳惠萍 吳 燕 劉志紅

膜性腎病(MN)是導致成人腎病綜合征(NS)主要的病理類型之一[1]。根據(jù)是否存在明確的病因，可分為特發(fā)性膜性腎病(IMN)和繼發(fā)性MN。導致繼發(fā)性MN的病因主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎及丙型肝炎病毒感染、非類固醇類抗炎藥、金制劑、青霉胺等藥物及腫瘤[2,3]。近年來，不斷有惡性腫瘤相關MN的報告[4]，但文獻報告腫瘤相關性MN的臨床表現(xiàn)及病理特點與IMN并無明顯差異[5，6]。至今為止，腫瘤相關性MN的診斷主要是根據(jù)腫瘤與MN發(fā)病時間相近而進行，缺乏特異性指標與IMN相鑒別[5]。為此，本文收集了近年來南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所經(jīng)臨床及病理明確診斷MN，同時合并有惡性腫瘤患者，分析惡性腫瘤來源、MN的臨床和病理特點，并對血清抗M型磷脂酶A2受體(PLA2R)自身抗體進行檢測，同時觀察腎組織IgG亞型沉積特點，探討腫瘤與MN之間的關系。

對象和方法

研究對象10例患者均為2005年12月～2008年12月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所住院并行腎活檢患者。入選標準如下：(1)腎臟組織學及免疫病理改變符合MN的特點；(2)診斷MN同時或前后1年內(nèi)經(jīng)臨床和病理明確診斷有惡性腫瘤；(3)排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎及丙型肝炎感染等繼發(fā)性原因導致的MN，未使用非類固醇類消炎藥物、金制劑、青霉胺等藥物，無有機溶劑及汞接觸史。

一般資料采用回顧性分析方法，收集患者病史，記錄入選患者的年齡、性別、吸煙史，病程、臨床表現(xiàn)，相關腫瘤的影像學和病理資料，治療及轉歸情況。

實驗室指標記錄腎活檢時實驗室檢查結果，包括尿沉渣紅細胞計數(shù)、24h尿蛋白定量、血常規(guī)、血漿白蛋白、膽固醇、血肌酐(SCr)、血清自身抗體、血清補體水平、腫瘤標志物。并記錄最后一次隨訪結果。

高血壓：收縮壓≥140 mmHg或(和)舒張壓≥90 mmHg；大量蛋白尿：尿蛋白定量≥3.5g/24h；低白蛋白血癥：血清白蛋白<30 g/L。貧血指男性血紅蛋白<120 g/L、女性血紅蛋白<110 g/L。

腎臟病理檢查所有患者均在B超引導下行腎穿刺活檢術，標本均進行常規(guī)光學顯微鏡及免疫熒光檢查。重點觀察腎小球基膜病變、球內(nèi)浸潤細胞，腎小管間質浸潤細胞和間質纖維化等。免疫熒光：冰凍切片行直接免疫熒光法IgG、IgA、IgM及C3、C4、C1q染色，觀察各種免疫球蛋白及補體在腎臟的沉積部位、強度和分布特點。免疫球蛋白和補體染色強度用陰性(-)，1+，2+表示。電鏡：腎組織常規(guī)制片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色在Hitach 7500電鏡下觀察。

腎小球IgG亞型沉積檢測采用間接免疫熒光法檢測。冰凍切片吹干，10%小牛血清封閉15 min，PBS洗5 min；分別滴加1∶200稀釋一抗為鼠抗人IgG1單抗(sigma，clone 8c/6-39)，IgG2單抗(sigma，clone HP-6014)，IgG3單抗(sigma，clone HP-6050)、IgG4單抗(sigma，clone HP-6025)孵育2h。PBS沖洗5 min，加FITC標記的兔抗鼠IgG(1∶50，DAKO)二抗孵育30 min。吹干，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結果。IgG亞型的熒光強度用陰性(-)，1+，2+表示。

血清抗M型PLA2R抗體的檢測[7]

腎小球蛋白抗原的提取 用篩網(wǎng)分離腎小球，將腎小球懸于等體積的100 mmol/L Tris中，在-80℃凍融。加入等體積的RIPA緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)，同時加入1x 蛋白酶抑制劑，振蕩混勻。離心去除RIPA溶液中不溶的碎片。

Western印跡 將提取的蛋白抗原加入Tris-HCl Ready膠，進行電泳。在包含15%甲醇的Tris-甘氨酸轉移緩沖液中將蛋白電轉移在Immobilon硝酸纖維素膜上。將膜用包含1%牛酪蛋白的封閉液室溫封閉1h。患者血清(腎活檢同時取血，分離血清冰凍備用)用封閉液1∶25稀釋，與已轉移人腎小球提取蛋白的硝酸纖維素膜室溫孵育1h。洗滌后與羊抗人IgG4(1∶3 000)室溫孵育1h，洗滌，加入HRP標記的驢抗人IgG(1∶40 000)。洗滌，在化學發(fā)光底物中孵育3 min，用放射自顯影膠片曝光，用Kodak 自動洗片機沖洗底片。

結 果

臨床表現(xiàn)10例患者中男性9例，女性1例，起病年齡40～65歲，平均(53.6±6.67)歲。本組患者腎活檢前僅3例出現(xiàn)與腫瘤有關的臨床表現(xiàn)，7例未出現(xiàn)任何腫瘤的癥狀，在常規(guī)中檢查或隨訪中發(fā)現(xiàn)腫瘤。其中肺癌5例，僅1例有咳嗽、咯血癥狀，行肺癌手術前尿檢發(fā)現(xiàn)蛋白尿；其余4例患者無肺部癥狀，均在入院常規(guī)X線胸片檢查中發(fā)現(xiàn)肺部占位，經(jīng)胸部CT和(或)支氣管鏡檢查確診為肺癌。胃癌2例，1例患者水腫、蛋白尿同時出現(xiàn)嘔血、黑便，入院后行胃鏡組織活檢檢查確診；1例患者腎活檢術后常規(guī)上消化道鋇餐發(fā)現(xiàn)腫瘤。結腸癌1例，入院后有明顯腹脹，多次查糞隱血陽性經(jīng)腸鏡檢查病理確診。舌癌、喉癌各1例，分別在診斷MN后6月、8月門診隨訪中發(fā)現(xiàn)腫瘤，行手術切除而確診。所有患者中僅第10例肺癌患者腫瘤標志物CEA、CA125及鐵蛋白升高，其余患者腫瘤標志物檢查均為陰性。10例中有8例患者有長期大量吸煙史，吸煙時間超過20年，每天超過20支。

腎臟損害的主要表現(xiàn)為水腫、蛋白尿。9例(90%)以水腫為首發(fā)癥狀，僅1例(10%)以咳嗽、咯血起病。所有患者均有蛋白尿，8例(80%)患者表現(xiàn)為NS，2例(20%)患者尿蛋白<3.0 g/d，其中1例患者腎活檢前已行肺癌切除術并行化療，尿蛋白減少。僅第8例患者尿沉渣紅細胞檢查有少量鏡下血尿，其余患者尿紅細胞均陰性。所有患者SCr正常，3例(30%)患者血尿素氮偏高。2例(20%)伴有輕度貧血，6例(60%)患者有高血壓史。4例(40%)患者血清ANA陽性，血清補體均正常(表1)。

表1 腫瘤相關膜性腎病患者基本情況及治療預后

腎臟病理所有患者光鏡下均可見腎小球外周袢僵硬，基膜增厚，無明顯內(nèi)皮細胞增生；可見輕度系膜細胞增生和系膜基質增多，未見腎小球節(jié)段袢壞死、新月體等病變。部分患者腎小球內(nèi)有少量浸潤細胞(>5個/球)，多數(shù)為單個核細胞和中性粒細胞。PASM-Masson染色下可見上皮側嗜復紅物沉積及嗜銀物形成，均無系膜區(qū)和內(nèi)皮下嗜復紅物沉積(圖1A)。5例患者腎間質中有少量浸潤細胞灶性聚集，主要為單個核細胞為主和中性粒細胞，主要分布于管周毛細血管。3例患者有輕度間質纖維化，余7例患者腎小管間質基本正常。6例患者腎間質可見小動脈透明變性，未見血管壁炎細胞浸潤。

免疫病理所有患者均可見IgG沿腎小球毛細血管壁呈顆粒樣沉積。9例患者有補體C3沉積，8例患者同時伴有補體C4沉積，7例患者同時有補體C1q沉積。5例患者同時有C4、C1q沉積血管袢。1例患者可見IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q均有沉積(表2)。

表2 腫瘤相關性膜性腎病抗PLA2R 抗體和 IgG 亞型檢測結果

電鏡10例患者中1例為MN I期，4例為II期，4例為III期，1例為IV期。所有患者均存在上皮側電子致密物沉積，其中7例患者電子致密物呈節(jié)段分布。3例患者系膜區(qū)有少量電子致密物沉積，1例患者可見內(nèi)皮下少量電子致密物沉積。所有患者均可見腎小球足細胞胞質微絨毛化，足突廣泛融合(圖1B)。

腎小球IgG亞型沉積特點本組患者的IgG亞型沉積情況見表2。10例患者腎小球IgG1沉積均為強陽性2+；9例患者腎小球有IgG2沉積，其中3例陽性2+，6例弱陽性1+；6例患者同時有IgG3弱陽性沉積1+；2例患者有IgG4沉積為陽性2+，其余患者IgG4沉積均為陰性(圖1C，D)。

血清抗M型磷脂酶A2受體自身抗體檢測結果10例中3例血清抗 PLA2R自身抗體檢測為陽性，其余7例患者抗體檢測均為陰性。2例抗 PLA2R抗體陽性患者腎組織中IgG4沉積強度與IgG1沉積相當(圖1E，F(xiàn))，另1例患者腎組織中IgG4沉積為陰性(表2)。

圖1 腫瘤相關膜性腎病病理改變及腎組織IgG亞型染色結果

治療及預后隨訪1～3年不等，抗 PLA2R自身抗體檢測為陽性3例患者中，1例患者胃癌切除術后12月，仍持續(xù)NS。另2例患者腫瘤術后半年蛋白尿緩解，但隨后再次出現(xiàn)蛋白尿，經(jīng)檢查并未出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或轉移?？?PLA2R自身抗體陰性7例患者中，1例胃癌患者未能手術，持續(xù)NS，于診斷明確后9月死亡，另1例乙狀結腸癌患者手術時已出現(xiàn)有淋巴結轉移，術后持續(xù)大量蛋白尿，嚴重低蛋白血癥，不能耐受化療于術后6月死亡。另1例胃癌患者在術后2年死亡。2例患者腫瘤術后6個月尿蛋白明顯減少，1年內(nèi)達到完全緩解至今。余2例患者未能行手術切除腫瘤，僅行化療，仍持續(xù)NS狀態(tài)(表1)。

討 論

MN是導致成人尤其是中老年人NS的常見病理類型之一。文獻報道約3%～13%的MN繼發(fā)于惡性腫瘤，而且常常是惡性腫瘤的首發(fā)癥狀[8,9]，因而惡性腫瘤是中老年MN患者不可忽視的一個繼發(fā)病因[6,10]。本研究中10例患者年齡平均在54歲左右，以NS為主要表現(xiàn)，腎臟病理為MN。臨床上可除外乙型肝炎、丙型肝炎感染等繼發(fā)性原因導致的MN，未使用非類固醇類消炎藥物、金制劑、青霉胺等藥物，無汞等有毒物質接觸史。盡管4例患者抗核抗體陽性，但臨床表現(xiàn)及病理均可排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡。影像學和組織病理報告均提示惡性腫瘤存在。因此，臨床需高度考慮MN的發(fā)病與惡性腫瘤相關，但腫瘤與MN均是老年人的常見疾病之一，因而也不能完全除外腫瘤與IMN同時存在。

本研究中10例患者均為來源于上皮細胞的腫瘤，其中肺癌占半數(shù)，提示肺鱗狀細胞癌和腺癌等上皮細胞腫瘤更易于發(fā)生MN。也有文獻報告引起MN主要為實體腫瘤，其中肺癌最多見，其次為胃癌、腸癌、前列腺癌和乳腺癌等[5]。需注意的是，本組患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤前，僅少數(shù)患者存在與腫瘤相關的臨床癥狀，多數(shù)患者并無臨床表現(xiàn)提示腫瘤存在，血清腫瘤標志物也為陰性，僅在臨床篩查中發(fā)現(xiàn)腫瘤。因此，對于MN患者，不能單純依靠臨床表現(xiàn)和腫瘤標志物是否陽性排查有無腫瘤。對于老年的MN患者，要仔細觀察X線胸片，必要時行胸部CT檢查；而對有大便潛血持續(xù)陽性患者，需行胃鏡或腸鏡檢查來除外胃腸道腫瘤。另外，2例患者經(jīng)治療后蛋白尿始終不能緩解，在隨訪過程中經(jīng)仔細檢查發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤存在。因此，MN隨訪過程中，要密切注意病情變化，對常規(guī)治療不緩解的患者，定期進行全身檢查，以除外腫瘤的存在。

本組患者臨床主要表現(xiàn)為NS。盡管部分患者病理改變可見腎小球內(nèi)有少量單個核細胞和中性粒細胞浸潤，但其他繼發(fā)性MN也可出現(xiàn)相同的病理改變[11]。因此，僅從臨床表現(xiàn)與病理改變無法將腫瘤相關MN與IMN相區(qū)別。既往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關腎病是否緩解與腫瘤本身的治療是否有效密切相關[12,13]。Lefaucheur等[10]報告24例腫瘤相關MN，12例腫瘤獲得緩解的患者中6例NS緩解；在12例腫瘤未愈的患者中，無一例NS獲得緩解。本研究中，血清抗PLA2R自身抗體陰性患者中，如能使腫瘤得到完全緩解，則NS可能達到完全緩解；而如果腫瘤不能切除，則NS長期不緩解，提示MN與惡性腫瘤相關。值得注意的是，本組中3例抗PLA2R自身抗體陽性中1例胃癌切除術后12月仍持續(xù)蛋白尿，2例患者在腫瘤切除術后出現(xiàn)蛋白尿一度緩解，但隨后再次出現(xiàn)蛋白尿，而臨床仔細搜尋，并未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移或復發(fā)。因此，這3例患者蛋白尿是否緩解與腫瘤治療無關，提示3例患者惡性腫瘤可能并非導致MN的原因。

腫瘤相關性MN的發(fā)病機制仍不清楚。有文獻報告在惡性腫瘤患者血清、腫瘤組織及腎組織中均找到了腫瘤抗原成分，且免疫熒光染色顯示CEA與IgG及C3在血管袢分布相似[14,15]，可能是腫瘤抗原種植在上皮側形成原位復合物，也可能是循環(huán)免疫復合物沉積于上皮側，但至目前為止，尚無確切證據(jù)證實腫瘤抗原是MN致病的主要原因[16]。最近，Beck等[7]的研究表明M型的PLA2R是IMN的靶抗原，37例IMN患者中有26例(70%)抗M型PLA2R抗體陽性，血清中的抗PLA2R自身抗體也以IgG4為主，而且其滴度與患者蛋白尿的消長之間有一定的相關性。抗PLA2R自身抗體的發(fā)現(xiàn)和檢測對IMN的診斷提供了一個理想的標志物[17]?？紤]本組患者MN的發(fā)病可能與腫瘤相關，其抗原與抗體類型就應不同于IMN，因此，我們在這一方面也進行了有益的探索。我們的研究發(fā)現(xiàn)10例患者中僅有3例(30%)血清抗PLA2R自身抗體為陽性，明顯低于Beck等[7]在IMN中要檢出的陽性率。進一步分析本組患者腎組織IgG亞型后發(fā)現(xiàn)，本組7例血清抗PLA2R自身抗體陰性患者腎組織沉積的IgG亞型以IgG1為主，IgG4為陰性。Ohtani等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關的MN腎小球IgG亞型的沉積以IgG1和IgG2為主，不同于IMN腎小球以IgG4沉積為主。此結果進一步印證了腫瘤相關MN患者的自身抗體不同于IMN，而可能是腫瘤相關抗原引起的自身抗體。鑒于此，提示腫瘤相關的MN發(fā)病機制不同于IMN。3例抗PLA2R自身抗體陽性的患者中，2例患者腎組織IgG1與IgG4均為陽性沉積，且熒光染色強度相當，提示IMN同時合并惡性腫瘤存在。

盡管本研究病例數(shù)相對較少，但對腫瘤相關MN研究仍有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)惡性腫瘤相關性MN患者抗PLA2R抗體陰性，腎組織以IgG1沉積為主提示其發(fā)病機制不同于IMN。少數(shù)腫瘤相關性MN患者血清中存在抗PLA2R抗體，腎組織同時存在IgG1與IgG4共沉積，腫瘤緩解與腎病緩解無明顯相關，提示可能為IMN合并腫瘤。另外，臨床醫(yī)師需注意關注MN患者的血清PLA2R抗體檢測和腎組織IgG亞型的沉積情況，對血清PLA2R抗體陰性和腎組織以IgG1亞型沉積為主的老年MN患者要仔細排查，以發(fā)現(xiàn)隱匿的腫瘤。

致謝：本研究中血清抗M型磷脂酶A2受體自身抗體檢測得到美國波士頓大學醫(yī)學院Salant DJ教授和Beck LH教授的幫助，在此表示感謝！

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