粟 挺 ，劉愛玲 ，陳信波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 210128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

隨著模式植物擬南芥和水稻全基因組測(cè)序工作的完成，植物基因組學(xué)的工作重心已由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，因此迫切需要一種高效、高通量分析方法從生物個(gè)體的整體水平闡明基因功能。RNA干擾是通過外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，其表現(xiàn)的性狀類似于基因功能缺失產(chǎn)生的表型[1-2]。RNA干擾現(xiàn)象自20世紀(jì)90年代中期被發(fā)現(xiàn)以來，就被廣泛應(yīng)用于基因功能的分析驗(yàn)證，成為后功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)；在農(nóng)作物選育方面也被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的品種改良和農(nóng)作物的抗病毒[3]研究。進(jìn)行RNA干擾研究需構(gòu)建可轉(zhuǎn)錄為雙鏈RNA的表達(dá)載體，然后獲得基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而分析目的基因的功能，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得遺傳上穩(wěn)定的突變體。強(qiáng)啟動(dòng)子下游插入反向重復(fù)片段的表達(dá)載體是誘導(dǎo)RNA干擾的最基本結(jié)構(gòu)，最有效的雙鏈RNA構(gòu)件是能轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾RNA（hairpin RNA,hpRNA）[4]。研究者一般從方法是否簡(jiǎn)便、快捷、成功率高來評(píng)價(jià)植物RNA干擾載體構(gòu)建方法的優(yōu)劣。筆者對(duì)目前廣泛使用的構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體的4種方法進(jìn)行了歸納和總結(jié)。

1 傳統(tǒng)的“酶切—連接”方法構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體

“酶切—連接”方法是構(gòu)建RNA干擾載體最常用的方法，被廣泛應(yīng)用于各種生物之中[5-8]。其構(gòu)建過程是：通過PCR方法得到目的基因的片段（添加了合適的酶切位點(diǎn)），使之正反相連形成順式片段和反式片段，然后在順反式片段之間插入一段中間間隔序列以增強(qiáng)基因沉默效果[9-10]，最后將表達(dá)載體和RNA干擾片段相連接，形成可用于遺傳轉(zhuǎn)化的RNA干擾表達(dá)載體。

傳統(tǒng)的“酶切—連接”方法對(duì)于在載體上添加1到2個(gè)基因比較容易，對(duì)于需添加多個(gè)基因的表達(dá)載體是比較困難的。除此之外，這種方法的試驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，至少需要3個(gè)“酶切—連接”的循環(huán)才能完成載體構(gòu)建，耗時(shí)耗力；構(gòu)建成功率不太高，在添加最后一個(gè)基因片段時(shí)，無論是順式片段還是反式片段連接到表達(dá)載體上都比較困難；對(duì)原始載體和目的片段的限制條件比較多，原始載體至少有4個(gè)可用酶切位點(diǎn)，這就增加了原始載體選擇的難度。傳統(tǒng)的“酶切—連接”方法構(gòu)建RNA干擾載體是最原始的構(gòu)建方法，雖然成功地構(gòu)建了多個(gè)植物RNA干擾表達(dá)載體，但其過程相對(duì)比較繁瑣，受到限制因素也比較多，不適合做高通量的研究。

2 “零背景篩選”技術(shù)構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體

“零背景篩選”技術(shù)是Chen等[11]開發(fā)出來的一種高通量和高效率的構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體的方法。該方法只需簡(jiǎn)單的兩步PCR反應(yīng)（圖1）就能形成干擾載體所需的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，免去了傳統(tǒng)方法中一系列的“酶切—連接”過程；并且此方法篩選陽性克隆的方法簡(jiǎn)單，且出現(xiàn)“假陽性”的概率非常小，幾乎為零，所以叫做“零背景篩選”。通過中間載體中的致死基因ccdB來篩選陽性克隆，與目的基因連接成功的載體能存活，反之不能存活。此方法只需兩步簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)和一次“酶切—連接”過程就能完成RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建。其具體步驟如下。

2.1 兩步PCR反應(yīng)

第一步，PCR過程中使用的引物P2和P4是在正常引物前加上一個(gè)含有特殊序列的接頭，而引物P2前面的接頭和P4前面接頭的序列是反向互補(bǔ)的。第二步，PCR過程所用的DNA聚合酶是一種特殊的酶，它可以在PCR產(chǎn)物后面加上A尾巴，如圖1。

圖1 兩步PCR反應(yīng)

2.2 一次“酶切—連接”過程

表達(dá)載體PCXUN和PCR產(chǎn)物的“酶切—連接”（圖2）。表達(dá)載體PCXUN經(jīng)過XcmI限制性內(nèi)切酶酶切后，會(huì)形成一個(gè)T尾巴，正好與PCR產(chǎn)物的A尾巴形成TA克隆。由于原始表達(dá)載體PCXUN中的致死基因ccdB被酶切掉，重組干擾載體不含致死基因ccdB，因此陽性克隆能存活。

圖2 “酶切-連接”過程

“零背景篩選”技術(shù)通過經(jīng)典的重組PCR方法[12]將兩個(gè)或多個(gè)基因片段通過一個(gè)基因片段的3′端與另一個(gè)基因片段的5′端的互補(bǔ)，利用重疊延伸的方法進(jìn)行高效和快速的體外基因片段拼接。應(yīng)用此方法構(gòu)建目的基因的RNA干擾構(gòu)件的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，在兩條引物前需分別加上一對(duì)序列反向互補(bǔ)的接頭，此外這個(gè)方法需要進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，應(yīng)使用保真性高的DNA聚合酶以保證擴(kuò)增的真實(shí)性。在陽性重組子的篩選過程中由于原始載體致死基因ccdB的存在，導(dǎo)致陽性重組子的篩選效率極高。此方法只需兩步PCR反應(yīng)就能得到RNA干擾構(gòu)件[13]，只需一步酶切—連接過程即可以將干擾構(gòu)件連接于載體上，構(gòu)建成RNA干擾表達(dá)載體，所以大大降低了對(duì)原載體上可用酶切位點(diǎn)的要求。使用這種技術(shù)，Chen等構(gòu)建了一套由12個(gè)臨時(shí)載體和12個(gè)穩(wěn)定載體組成的遺傳轉(zhuǎn)化載體用來研究植物的基因表達(dá)，并在水稻和擬南芥中驗(yàn)證了這些載體的表達(dá)。這種方法較傳統(tǒng)構(gòu)建方法更簡(jiǎn)便、適用性更廣泛。

3 Gateway技術(shù)構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體

Gateway技術(shù)是Invitrogen公司開發(fā)的一項(xiàng)基因克隆和表達(dá)的新技術(shù)，只需BP和LR兩個(gè)反應(yīng)就可以完成RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建，不需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。

Gateway技術(shù)過程：BP反應(yīng)（圖3）主要是將目的基因或PCR產(chǎn)物重組入供體載體(donor vector)。在獲得目的基因PCR片段時(shí)，需在PCR產(chǎn)物的5′端加入attB1位點(diǎn)，3′端加入attB2位點(diǎn)，供體載體兩端具有attP1和attP2位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物和供體載體在BP反應(yīng)酶催化下，通過同源重組形成新的位點(diǎn)attL1和attL2，生成帶有目的基因的入門載體。LR反應(yīng)（圖4）主要是將目的基因從入門載體重組入目的載體，反應(yīng)由LR反應(yīng)酶混合物催化。入門載體基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體上含有attR1和attR2位點(diǎn)，在LR反應(yīng)酶作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，從而將目的基因轉(zhuǎn)移到目的表達(dá)載體中。篩選陽性克隆的機(jī)制是：入門載體質(zhì)粒上帶有卡那霉素抗性基因，而目的載體質(zhì)粒上帶有壯觀霉素抗性基因，重組目的載體質(zhì)粒的選擇標(biāo)記為壯觀霉素[14]。具體工作原理見圖4。

圖3 BP反應(yīng)

圖4 LR反應(yīng)

Gateway技術(shù)是一項(xiàng)基因克隆和表達(dá)的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的“酶切—連接”方法構(gòu)建表達(dá)載體比較，該技術(shù)具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，即只需通過高效的BP和LR反應(yīng)就可實(shí)現(xiàn)把目的基因定向轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中，克隆效率可達(dá)到95%[15]。Gateway技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體具有簡(jiǎn)便、快捷、成功率高、對(duì)原始載體和目的片段的限制少等優(yōu)勢(shì)，可避免構(gòu)建RNA干擾載體時(shí)存在的困難和繁瑣的“酶切—連接”步驟。很多科研工作者已利用Gateway技術(shù)成功地構(gòu)建了多種RNA干擾表達(dá)載體用于研究基因的功能，姜玲等[16]成功構(gòu)建了番木瓜環(huán)斑病毒CP基因的RNA干擾表達(dá)載體；徐化學(xué)等[17]利用Gateway技術(shù)快速成功地構(gòu)建了水稻OsDAD1基因的RNA干擾表達(dá)載體并用以研究基因的功能；晏立英等[18]構(gòu)建了花生條紋病毒基因的RNA干擾表達(dá)載體。

4 以人工miRNA為基礎(chǔ)的方法構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體

miRNA是一類內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，約為22 nt[19-20]，廣泛存在真核生物中。其小分子RNA和靶mRNA通過特異的堿基配對(duì)結(jié)合，形成RISC沉默復(fù)合體，阻礙基因的正常表達(dá)。人工miRNA[21-22]技術(shù)指利用miRNA的表達(dá)特性，使用生物體內(nèi)源的miRNA前體[23-24]作為人工miRNA的表達(dá)框架，產(chǎn)生出小分子RNA介導(dǎo)的靶基因沉默。因此，在二級(jí)結(jié)構(gòu)不變的前提下，可以通過改變生物體內(nèi)源miRNA前體的一些核苷酸，生成針對(duì)特異目的基因沉默的人工miRNA，目前被廣泛使用的miRNA前體骨架有 ath-miR159a，ath-miR164b，ath-miR169d，ath-miR172a，ath-miR319a和 osa-miR528。

Weigel等[25]建立了一個(gè)人工miRNA設(shè)計(jì)平臺(tái)，在 WMD3（Web MicroRNA Designer,http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi）系統(tǒng)中，可以對(duì)100多種植物設(shè)計(jì)人工miRNA。使用WMD3的“Designer”工具，選擇所要干涉的植物的基因組數(shù)據(jù)庫，輸入目的基因序列，在線提交，該系統(tǒng)通過和植物基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，防止“脫靶”，并根據(jù)人工miRNA的相關(guān)參數(shù)（如Tm值等）列出候選的人工miRNA。Weigel等提供了基于擬南芥miR319a、水稻miR528、萊氏衣藻的pChlamiRNA2/3載體作為構(gòu)建人工miRNA的模板，用PCR方法替換載體上miRNA片段，構(gòu)建成人工miRNA表達(dá)載體。

人工miRNA技術(shù)是一項(xiàng)新興的生物技術(shù)，具有高效、精確、可控等優(yōu)點(diǎn)，是替代RNA干擾的有效工具。幾乎所有可以利用RNA干擾的地方都可以用人工miRNA替代。與RNA干擾技術(shù)相比，人工miRNA具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。人工miRNA可以同時(shí)干涉多個(gè)序列具有同源性的基因，因此可以用來研究多拷貝的基因或功能存在互補(bǔ)效應(yīng)的基因；利用人工miRNA可以建立基因沉默的突變體庫，進(jìn)行基因組功能研究。

5 結(jié)語

RNA干擾技術(shù)作為一種基因工程策略，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的遺傳改良、抗病毒和抗寄生線蟲[26]等方面的研究。構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體是最常用和最基本的試驗(yàn)步驟。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，植物RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建方法也會(huì)不斷推陳出新，變得越來越簡(jiǎn)便、有效?！傲惚尘昂Y選”技術(shù)突破了傳統(tǒng)的限制性酶切法進(jìn)行基因連接的概念，將重組PCR技術(shù)應(yīng)用于植物RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建，是近兩年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，被證明是可行的；Gateway技術(shù)利用同源重組的原理來構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體，也是一種簡(jiǎn)便、快捷的方法，適合高通量的研究；人工miRNA的方法具有干擾成功率高、并且允許堿基錯(cuò)配、允許同時(shí)表達(dá)幾個(gè)人工miRNA分子，組織特異性的調(diào)節(jié)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[27]，在植物發(fā)育調(diào)控、逆境應(yīng)答及激素調(diào)節(jié)等方面應(yīng)用價(jià)值更高[28]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，富有創(chuàng)新性的RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建方法必將為植物基因功能研究提供更有力的技術(shù)支撐。

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