陳麗君，杜孟芳，安世恒，張松斗，蔣金煒

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南 鄭州 450002)

去飽和酶是一種催化脫飽和作用的功能性酶，能使飽和脂肪酸轉變成不飽和脂肪酸.酰基CoA去飽和酶是脂肪酸去飽和酶的1種，存在于真菌和動物的內(nèi)質網(wǎng)膜上并與膜結合，功能是在脂酰CoA上引入雙鍵［1］.根據(jù)脫飽和酶在脂酰鏈中引入雙鍵的位置不同，可以將脫飽和酶分為Δ9，Δ12，Δ6，Δ5 等類別，分別在脂酰鏈的 Δ9，Δ12，Δ6，Δ5等位置引入雙鍵［2］.在?；o酶A去飽和酶家族中，編碼Δ9去飽和酶同源體的基因已經(jīng)從酵母類到脊椎動物中被克隆出來，包括節(jié)肢動物如美洲花蜱(Amblyomma americanum)［3］、果蠅(Drosophila melanogaster)［4］、粉夜蛾(Trichoplusia ni)［5］.在國外，酰基輔酶AΔ9去飽和酶在很多昆蟲中都有研究，如馬尾松毛蟲(Dendrolimus punctatus Walker)、家蠶(Bombyx mori)、果蠅、粉夜蛾、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)等.研究顯示，?；o酶 AΔ9去飽和酶在脂肪酸代謝過程中和調(diào)節(jié)細胞膜流動性方面起重要作用［6～8］.目前對它的研究主要集中在昆蟲產(chǎn)生信息素過程中的作用［9］.而酰基輔酶AΔ9去飽和酶在棉鈴蟲幼蟲的脂肪酸代謝過程中具體有什么作用，還沒有相關報道.本試驗對棉鈴蟲酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因進行克隆，利用分子技術得到其cDNA全序列，并研究其在棉鈴蟲幼蟲的不同發(fā)育期、饑餓處理、注射激素后的轉錄水平，以期為深入探討?；o酶AΔ9去飽和酶在昆蟲脂肪酸代謝中的作用為防治害蟲提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與試劑

棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)為河南農(nóng)業(yè)大學昆蟲實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度27℃，光周期為L∶D=16∶8，相對濕度為75%.載體 pDM －T載體購自TakaRa公司，大腸桿菌JM109為河南農(nóng)業(yè)大學昆蟲實驗室保存.主要試劑為總RNA抽提試劑(RNAiso Reagent)，限制性內(nèi)切酶(BamHI和HandIII)，3’-Full RACE 試劑盒，rTaqDNA 聚合酶，DL2000 Marker，熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)，TaKaRa One Step RNA PCR Kit試劑盒購自TaKaRa公司;反轉錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)為MBI公司產(chǎn)品;其他均為國產(chǎn)或進口分析純試劑.

1.2 試驗方法

1.2.1 棉鈴蟲總RNA的提取 取5齡初期的棉鈴蟲幼蟲后半部放入經(jīng)DEPC處理過的Eppendorf管中勻漿，用RNAiso Reagent法提取RNA(具體參照Takara公司試劑說明書).用紫外分光光度計檢測其純度和濃度.

1.2.2 引物設計 對其他昆蟲酰基輔酶AΔ9去飽和酶的核苷酸序列進行同源比對，在保守區(qū)設計并合成引物.本研究所用引物及其用途見表1，引物由上海博尚生物技術有限公司合成.

1.2.3 反轉錄擴增棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因片斷 根據(jù)反轉錄試劑盒說明，以5齡幼蟲總RNA為模板合成cDNA第1鏈，隨后以合成的cDNA第1鏈為模板，利用GP1和GP2引物進行PCR擴增.PCR反應條件為:94℃變性3 min;隨后40個循環(huán)的擴增，擴增條件為94℃ 1 min，60℃50 s，72 ℃ 1 min;最后72 ℃ 10 min.

1.2.4 棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因克隆和測序 反應結束后，取上述PCR反應液(5～10 μL)進行瓊脂糖凝膠(質量濃度為1.3%)電泳，確認RT-PCR擴增產(chǎn)物.電泳、純化后，按照載體PDM-T連接試劑盒說明書，將純化的目的片段與PDM-T載體連接，重組質粒轉化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細菌，進行藍白斑篩選.挑取檢測出的陽性克隆白斑接種于附有Ampicillin 80 mg·L－1的LB培養(yǎng)基中，37℃下180 r·min－1過夜培養(yǎng)后，進行質粒的提取(具體過程參照SanPrep柱式質粒DNA抽提試劑盒說明書).將質粒送至上海生工進行測序.

表1 引物序列列表Table1 List of the primer sequences

為了獲得棉鈴蟲酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因完整cDNA序列，根據(jù)上述獲得的基因序列，設計合成基因特異性引物P3和P4并分別與3'RACE試劑盒中的Outer Primer和Inner Primer引物配對進行套式PCR擴增，設計合成基因特異性引物P5和P6分別與5'RACE試劑盒中的Outer Primer和Inner Primer引物配對也進行套式PCR擴增.按照試劑盒(3'-Full Race Core Set Ver.2.0;TaKaRa)進行3’RACE;按照試劑盒(5'－Full Race Core Set Ver.2.0;TaKaRa)進行 5’RACE.

1.2.5 序列分析 核苷酸序列分析采用Chromaspro軟件，氨基酸序列分析采用生物信息學在線工具 http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html，同源性比較采用NCBI中的BLAST工具，序列多重聯(lián)配采用Clustal W和Genedoc軟件.

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測 Real-time PCR采用相對定量的方法計算，以棉鈴蟲18 SrRNA為內(nèi)參基因，在 Mastercycler@ep realplex real-time PCR檢測系統(tǒng)上進行操作，反應條件如下:95℃預變性10 s，95 ℃15 s，55 ℃15 s，68 ℃20 s，共40 個循環(huán);95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s用于記錄溶解曲線.基因的相對表達量用2－△△Ct方法計算.

1.2.7 棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲幼蟲不同發(fā)育期的表達 利用合成的不同發(fā)育期棉鈴蟲幼蟲cDNA第1鏈作為模板，以P7和P8為引物進行Real-time PCR擴增，以18 S rRNA為內(nèi)參基因.相對定量計算方法同1.2.6.

1.2.8 饑餓處理對?；o酶AΔ9去飽和酶基因因轉錄水平的影響 對5齡初期的棉鈴蟲幼蟲進行饑餓處理，處理時間分別為 6，12，24，48 h，隨后各取2頭幼蟲進行RNA提取.反轉錄與Real Time PCR反應按照試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)使用說明進行.Real-time PCR操作和計算方法同 1.2.6.

1.2.9 激素處理對?；o酶AΔ9去飽和酶基因因轉錄水平的影響 將40 ng(20 μg·L－1)保幼激素類似物溶液(用丙酮溶解)注射在5齡初期的棉鈴蟲幼蟲腹部節(jié)間膜上，對照幼蟲注射丙酮.分別選取處理后3，6，12 h及對照的5齡幼蟲各2頭提取RNA.

將100 ng(50 μg·L－1)蛻皮激素(用酒精溶解)注射在5齡初期的棉鈴蟲幼蟲腹部節(jié)間膜上，對照幼蟲注射酒精.分別選取處理后3，6，12，24 h及對照的5齡幼蟲各2頭提取RNA.

Real-time PCR 操作和計算方法同1.2.6.

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲?；o酶 AΔ9去飽和酶基因序列測定

RT-PCR及RACE結果發(fā)現(xiàn)，該基因總長度為2 931 bp，編碼區(qū)長度為1 062 bp，編碼353個氨基酸殘基(圖1).Genbank登錄號為 HM629435.Ex-PAsy分析顯示，該基因編碼的蛋白質等電點為8.66，相對分子質量為40.66 kDa.同源性分析結果表明棉鈴蟲酰基輔酶AΔ9去飽和酶氨基酸序列與其他昆蟲的?；o酶AΔ9去飽和酶氨基酸序列具有很高的一致性(圖2)，與谷實夜蛾(Helicoverpa zea)、煙夜蛾(Helicoverpa assulta)一致性達到95%以上，與?；页嵋苟?Spodoptera littoralis)、紅帶卷蛾(Argyrotaenia velutinana)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的同源性一致性均達到85%以上，薔薇斜條卷葉蛾(Choristoneura rosaceana)為84%.系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明了?；o酶AΔ9去飽和酶基因在進化過程中的保守性.

圖1 棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因核苷酸序列、推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide，and deduced amino acid sequences of acyl-CoA delta-9 desaturase from Helicoverpa armigera

2.2 棉鈴蟲不同發(fā)育期?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄情況

熒光定量PCR分析結果顯示，不同發(fā)育期中，?；o酶AΔ9去飽和酶基因在5齡24 h到5齡72 h轉錄水平較高，在72 h時達到最高.在4齡12 h，4齡36 h，5齡12 h，5齡96 h直到蛹期2 d的轉錄水平較低.從4齡到5齡72 h，隨著幼蟲的生長，?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄水平基本呈增長趨勢.(圖4).

圖2 棉鈴蟲酰基輔酶AΔ9去飽和酶與其他昆蟲的氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignments analysis of Helicoverpa armigera acyl-CoA delta-9 desaturase and other insect homogous

圖3 棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶與其他昆蟲已知氨基酸的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of acyl-CoA delta-9 desaturase of Helicoverpa armigera and other reported insects

2.3 饑餓處理對棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉錄情況的影響

對5齡期2 d的棉鈴蟲幼蟲進行饑餓處理，提取RNA，進行熒光定量分析.結果表明，饑餓處理對?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉錄有較強的抑制作用(圖5).

2.4 注射激素對棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉錄水平的影響

2.4.1 注射保幼激素類似物對棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉錄水平的影響 利用丙酮對照、保幼激素類似物(Methoprene acid)對5齡初期的棉鈴蟲幼蟲進行注射，提取RNA，進行熒光定量分析.結果表明，注射保幼激素6 h時，對?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄表現(xiàn)出較強抑制作用(圖6).

圖4 ?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲不同發(fā)育期的轉錄水平Fig.4 Developmental transcription level of acyl-CoA delta-9 desaturase

圖5 饑餓處理后?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄水平Fig.5 Transcription level of hunger-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

圖6 受保幼激素刺激后?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄水平Fig.6 Transcription level of Methoprene acid-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

2.4.2 注射蛻皮激素對棉鈴蟲?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉錄水平的影響 利用體積分數(shù)為0.5%乙醇對照、蛻皮激素20E對5齡初期的棉鈴蟲幼蟲進行注射，提取RNA，進行熒光定量分析.結果表明，在注射6 h之內(nèi)無明顯作用，在注射12 h時，有明顯的促進作用，其相對轉錄水平最高.之后促進作用減弱(圖7).

圖7 受蛻皮激素刺激后?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉錄水平Fig.7 Transcription level of 20E-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

3 討論

酰基輔酶A去飽和酶在真核細胞中是普遍存在的，對調(diào)控膜的流動性起著重要作用［10］.在哺乳動物中，它不僅維持膜流動性，而且在脂肪酸代謝中起中心調(diào)節(jié)作用.因為?；o酶A去飽和酶是單不飽和脂肪酸(MUFA)生物合成的限速酶，有催化飽和脂肪酸的脂酰輔酶A脫氫的作用，其首選底物是軟脂酰和硬脂酰輔酶A.而單不飽和脂肪酸生物合成過程中的關鍵的一步就是在Δ9位引入的第1個順式雙鍵(在C9與C10之間)［11］.在昆蟲中，酰基輔酶A去飽和酶在許多生物反應過程中起重要作用，如果蠅?；o酶AΔ9去飽和酶活性對其體內(nèi)生理平衡、生長發(fā)育和雌性聯(lián)系信息素的生物合成有極大影響［12，13］.此外，?；o酶 AΔ9去飽和酶廣泛存在于蛾類性信息素腺體中［14］.所以，?；o酶A去飽和酶在昆蟲中幾乎所有的研究都集中于鱗翅目昆蟲性信息素生物合成的過程.鱗翅類昆蟲性信息素最普通的組成成分是不飽和脂肪酸(UFA)前體物的派生物，這些派生物在數(shù)量、位置、雙鍵幾何學方面都不一樣.而不飽和脂肪酸(UFA)前體物是由?；o酶A去飽和酶在專門的性信息素腺體中表達而產(chǎn)生的［15，16］.目前對?；o酶AΔ9去飽和酶基因的研究和認識越來越多，研究證明其在諸多重要的生物反應過程中擔任重要角色.

本研究利用RT-PCR及RACE的方法［17］克隆了?；o酶AΔ9去飽和酶基因，序列分析結果顯示出其氨基酸序列在昆蟲中非常保守，其一致性高達80%以上.這種高度的一致性說明了酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因在進化過程中是很保守的.

對于無脊椎的昆蟲來說，蛻皮是一個生物學奇跡，也是目前昆蟲生理生化研究的重點和難點.本研究分析了?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲中的時序的表達，發(fā)現(xiàn)該基因的表達與蛻皮激素的滴度變化相一致，推測可能是受蛻皮激素調(diào)控，進一步的激素處理也證實蛻皮激素誘導其表達，而保幼激素則抵消蛻皮激素對?；o酶AΔ9去飽和酶基因的誘導作用.昆蟲性信息素主要組成成分為不飽和脂肪酸(UFA)前體物的派生物，而酰基輔酶AΔ9去飽和酶的去飽和作用催化了這些物質的形成.所以說，其在昆蟲幼蟲脂肪酸代謝過程中也一定起著重要作用.本試驗盡管已經(jīng)克隆了酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因，并鑒定出了一些基本特性，但要闡明?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲幼蟲的脂肪酸代謝過程中的具體作用還有待進一步的研究.

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