吉林農業(yè)大學動物科技學院 王桂芹 李子平 牛小天

中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心 蘆洪梅 韓宇田

農業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室 趙朝陽

生長是生物體通過同化作用進行物質積累、細胞分裂或增殖的體積增大，動物真生長是結構、組織如肌肉、骨骼、器官的體積、蛋白質量的增加，所以生長多以體蛋白變化來表示（Perez，1995）。魚類的生長實際上是通過蛋白質合成完成的，RNA/DNA與蛋白質合成、魚類生長速度之間具有相關性，所以RNA/DNA比率能夠迅速地反映魚類當前營養(yǎng)狀況的變化，從而在較短的時間內準確地評定飼料的營養(yǎng)價值。魚類對蛋白質周轉代謝受到酶、激素和基因的調控。硬骨魚類的生長與其他脊椎動物一樣，也受到腦-腦垂體-肝臟生長軸的調控。許多研究表明，飼料通過影響魚類激素的分泌而調控生長，如飼料蛋白攝入數(shù)量和質量等（Gomez等，2004；Marti等，1996）。 但有關飼料能量和維生素B6對魚類蛋白質合成與調控的影響報道較少（Eales等，1992）。本試驗以烏鱧為試驗對象，選取飼料能量和維生素B6兩個重要的蛋白質代謝的調控因素，即探討飼料能量和維生素B6分別與蛋白質的交互作用對烏鱧蛋白質合成與調控的影響，以期為進一步闡明蛋白質代謝的調控機制，為生產上優(yōu)化烏鱧飼料配方，提高產量，降低成本提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 以魚粉為蛋白源，以魚油、大豆油、糊精和面粉為能源、吡哆醇鹽酸鹽（Sigma）為維生素B6的來源（用前進行包膜處理）、纖維素為填充物配制半精制日糧。試驗日糧為由3個蛋白水平（含34.7%、38.3%和41.8%可消化蛋白）和3個能量水平（14.5、16.0 MJ和17.5 MJ的可消化能）組合而成的9種配合飼料。試驗配方及其營養(yǎng)組成如表1所示，其中L、M和H分別表示3個蛋白質水平，數(shù)字1、2、3分別表示3個能量水平。試驗二共配制成由3個蛋白水平（34.7%、38.3%和 41.8%）和 3個維生素 B6水平（6、18 mg/kg和30 mg/kg飼料）組合而成的9種配合飼料。試驗配方及其組成如表2所示，其中L、M和H分別代表3個蛋白質水平，數(shù)字1、2、3分別代表3個維生素B6水平。飼料經制粒 （1.5 mm），曬干后置于-4℃冰柜中保存、備用。

1.2 飼養(yǎng)管理 生長試驗于2008年7月25日到2008年9月23日在安西水庫池塘網(wǎng)箱（1 m×1 m×1 m）中進行，烏鱧魚苗購于沈陽蘇家屯，飼養(yǎng)于土池中2個月，試驗前2 w挑選規(guī)格整齊1000尾魚置于網(wǎng)箱中進行馴養(yǎng)，期間從冰鮮雜魚逐漸過渡到配合飼料。待全部攝食配合飼料后，試驗開始前先停食24 h，稱重，隨后從馴養(yǎng)魚中每次隨機取30尾魚，每種飼料 3個重復，每個重復放養(yǎng)30尾魚，持續(xù)飼養(yǎng)8 w。試驗開始時從馴養(yǎng)魚中隨機取10尾稱重。試驗期間記錄死魚并稱重，在試驗結束前停食24 h，每個重復稱重，計算特定生長率。

1.3 測定指標

1.3.1 DNA、RNA含量的測定 生長試驗結束后，將魚饑餓1 d，從每個飼料組中隨機取烏鱧10尾，吸干體表水分，在每尾魚的背鰭基部取白肌和肝胰臟作為一個樣品，并于-20℃保存待測。具體方法如下：

標準曲線的測定： 配制濃度為 0、5、10、15、20 μg/mL和25 μg/mL的RNA標準液，濃度為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μg/mL 和 15.0 μg/mL DNA標準液。分別在260 nm和265 nm處測定RNA和DNA的吸收值（OD），RNA的標準曲線：y=0.0507x+0.0054 （R2=0.9997），DNA 的標準曲線：y=0.0177x+0.0006 （R2=0.9984），x 分別為 RNA 和DNA含量（μg/mL），y為RNA或DNA的OD值。

樣品中核酸的測定：取0.5000～1.0000 g魚白肌或肝胰臟，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入適量冷的0.01 mol/L檸檬酸三鈉勻漿，制備RNA和DNA原液。同上測定其OD值，從標準曲線查得核酸的含量并計算。

1.3.2 IGF-I的測定 生長試驗結束后，從每個飼料組中隨機取烏鱧10尾，MS-222（100 mg/L）麻醉，用一次性醫(yī)用注射器從尾靜脈取血，肝素抗凝，4℃靜置 24 h后，2500 r/min離心 10 min，分離血漿，-20℃保存?zhèn)溆谩貅k血漿用酸醇處理，去除結合蛋白。取40 μL血清，加入360 μL酸醇液，混均，25℃放置30 min，10000轉 4℃離心20 min，取上清0.2 mL，加入0.1 mLTris混均、離心，取上清液待測。烏鱧血清IGF-I含量采用IGF-I平衡飽和競爭放射免疫分析（RIA）法進行測定，試劑盒購自中國九鼎醫(yī)學生物工程有限公司（中國，天津）。用放免γ測量儀進行計數(shù)，檢測范圍為1.25～100 ng/mL。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（干質量）

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析，用Duncan’s法進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。生長、核酸含量和血中IGF-I分別進行雙變量相關分析。

2 結果

2.1 飼料能量與蛋白質的交互作用對烏鱧蛋白質合成與調控的影響 蛋白質和能量對烏鱧肌肉核酸和血中IGF-1含量的影響見表3。飼料蛋白質水平極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率 （P＜0.01），顯著影響RNA含量（P＜0.05）。在同一能量水平下，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量均隨飼料蛋白含量先升高后下降。能量水平極顯著地影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量 （P＜0.01）。在同一蛋白水平下，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量均隨飼料能量含量先升高后下降，蛋能比對烏鱧的RNA/DNA比率、RNA含量及DNA含量影響均不顯著（P＞0.05）。飼料蛋白質和能量水平顯著影響烏鱧血清IGF-I的含量（P＜0.05），IGF-I的含量均隨飼料蛋白質和能量水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。蛋能比對烏鱧的IGF-I的含量影響不顯著（P＞0.05）。核酸和血清中IGF-I與生長顯著相關，相關系數(shù)分別是0.943*和0.876*。

表2 試驗飼料配方及其營養(yǎng)組成（干質量）

2.2 飼料中維生素B6與蛋白質的交互作用對烏鱧蛋白質合成與調控的影響 蛋白質與維生素B6對核酸含量和血中IGF-1的影響見表4。飼料蛋白質水平極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01），隨著蛋白質水平的增加，烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量呈先升高后穩(wěn)定的趨勢。維生素B6極顯著影響烏鱧的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01）。在低和中蛋白質水平下，隨著維生素B6的添加，高劑量維生素B6組的RNA/DNA比率顯著增加（P＜0.05），高蛋白組維生素B6對烏鱧的RNA/DNA比率影響不顯著（P＞0.05）。在中和高蛋白水平下，隨著維生素B6的添加，RNA含量有增加的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），在低蛋白組，添加高維生素B6組的RNA含量顯著增加（P＜0.05），低添加量時與對照組差異不顯著（P＞0.05），飼料蛋白質和維生素B6水平及其交互作用對烏鱧的DNA含量均無顯著影響（P＞0.05）。飼料蛋白質水平極顯著影響烏鱧血清IGF-I的含量 （P＜0.01），除H3組外IGF-I的含量均隨飼料蛋白質和維生素B6含量升高而升高，維生素B6及蛋白質與維生素B6交互作用對其影響不顯著。核酸和血清中IGF-I與生長呈正相關，相關系數(shù)分別為0.886*和0.834*。

3 討論

表3 飼料能量與蛋白質的交互作用對烏鱧生長、核酸與IGF-I含量的影晌

白肌是魚類蛋白質合成用于沉積最高的組織，是表達魚體生長最有代表性的組織。魚類的生長主要是通過蛋白質的合成來實現(xiàn)的，真核生物細胞蛋白質合成是核酸數(shù)量和活性功能的體現(xiàn)（Higucra等，1999）。RNA/DNA 表示核糖體的數(shù)量或蛋白質的合成潛力或RNA的轉錄效率，亦是衡量組織蛋白質合成能力的指標，對翹嘴鲌（王桂芹等，2008）、虹鱒（Mathers 等，1993）、大菱鲆（Imsland等，2002）的研究表明，RNA/DNA不僅與魚體的生長有關，也與魚類的營養(yǎng)狀況有關。本試驗表明烏鱧肌肉的RNA/DNA與其生長正相關。魚類對蛋白質周轉代謝受到腦-腦垂體-肝臟生長軸的調控，生長激素的促生長效應主要是由IGF-I介導的，IGF-I是一種廣譜性促細胞分裂素，能促進鳥氨酸脫氫酶的活性及細胞內DNA、RNA和蛋白質的生物合成，最終引起細胞的增殖與分化，促進蛋白質的合成和結締組織及骨髓的產生（Tsai等，1995）。 大西洋鮭和尖吻鱸 （Anthony等，2004）、金頭鯛（Perez等，1995）血漿 IGF-I濃度變化與生長正相關，本研究也得到同樣的結果。表明肌肉核酸和血清IGF-I是衡量蛋白質合成和調控且反映魚類生長速度的重要參數(shù)之一。

蛋白質合成能力和血IGF-I的分泌受到生長階段、飼料營養(yǎng)狀況的影響與調控。對虹鱒（Mathers等，1993）、大菱鲆（Imsland 等，2002）的研究表明，快速生長發(fā)育期的魚類蛋白質合成能力可作為魚類生長的衡量指標。研究表明，飼料蛋白質水平的增加促進白肌蛋白質合成能力和生長是通過增加RNA/DNA和IGF-I來實現(xiàn)的。對翹嘴鲌（王桂芹等，2008）、鯉魚（Higucra 等，1998）的研究表明，飼料氨基酸的平衡程度對生長影響是通過蛋白質合成能力和IGF-I來調控的，但華益民和林浩然（2001）研究不同飼料蛋白水平對鯉魚內分泌的影響時發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質水平對IGF-ImRNA無顯著影響，可能是因為IGF-I表達的調節(jié)是一個相對緩慢的過程，試驗時間只有30 d的緣故。本試驗表明蛋白質是調控RNA/DNA和IGF-I的合成的一個重要調節(jié)因子。關于飼料能量和維生素B6對魚類RNA/DNA和IGF-I的影響未見報道。本試驗適宜蛋能比（23.3 g/MJ）通過提高血中IGF-I的含量來調控蛋白質的合成，從而促進生長，這與對真鯛（Marti等，1996）和虹鱒（Eales等，1992）的研究結果一致，即適宜蛋能比能促進激素的分泌，從而促進生長。本試驗說明可消化蛋白質水平在34.5%～42.0%時，飼料中增加維生素B6（18～30 mg/kg）的添加量，可促進蛋白質的合成，提高血中IGF-I的含量從而促進生長。這與在虹鱒（Smith等，1974）和羅非魚（Liral等，1995）餌料中應添加足量的維生素B6，可提高蛋白質的沉積率研究結果一致。在飼料低蛋白質水平條件下，蛋白質中含氮化合物的代謝強度較低，對飼料中維生素B6的需求量也較低；在飼料高蛋白質水平下將增加機體對維生素B6的需要量，所以一定水平飼料蛋白質需要一定量的飼料維生素B6作為其代謝過程中輔酶的前體來促進生長。

表4 飼料中維生素B6與蛋白質的交互作用對烏鱧生長、核酸與IGF-I含量的影晌

[1]華益民，林浩然.營養(yǎng)狀況對幼年鯉魚肝臟IGF-ImRNA表達的影響[J].動物學報，2001，47（1）：94 ～ 100.

[2]王桂芹，周洪琪，陳建明，等.飼料蛋白對翹嘴鲌蛋白質合成能力的影響[J].南京農業(yè)大學學報，2008，31（2）：149 ～ 153.

[3]Anthony R D，Christopher G B，Mattew P，et al.Correlation of plasma IGF-I concentrations and growth rate in aquacultured finfish：a tool for assessing the potential of new diets[J].Aquac，2004，236：583 ～ 592.

[4]Eales J G，Maclatcy D L，Higgs D A.The influence of dietary protein and calric content on thyroid function and hepatic thyrocine 5-monodeiodinase activity in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss[J].Can J Zool，1992，70： 1526 ～ 1535.

[5]Gomez-Requeni M，Mingarro J A，Calduch-Giner F，et al.Protein growth performance，amino acid utilization and somatotropic axis responsiveness to fish meal replacement by plant protein sources in gilthead sea bream（Sparus aurata） [J].Aquac，2004，232：492 ～ 510.

[6]Higucra M，Garzon M C，Hidalgo，et al.Influence of temperature and dietary protein supplementation either with free or coated lysine on the fractional protein turnover rates in the white muscle of carp[J].Fish Physiol Biochem，1998，18：85 ～ 95.

[7]Higucra H，Akharbach M C，Hidalgo P.Liver and white muscle protein turnover rates in the European eel （Anguilla anguilla）：effects of dietary protein quality[J].Aquac，1999，179：203 ～ 216.

[8]Imsland A K，F(xiàn)oss A，Bonga S W.Comparision of growth and RNA/DNA ratios in three populations of juvenile turbot reared at two salinities[J].J Fish Biol，2002，60：288 ～ 300.

[9]Liral C，Leamaster B R，Brock J A.Pyridoxine requirement of fingerling red hybrid tilapia grown in seawater[J].J Appl Aquac，1995，5（3）：49 ～ 60.

[10]Marti-Palanca H，Martinez-Barbera J P，Pendon C，et al.Growth hormone as a function of age and dietary protein：energy ratio in a marine teleost，the gilhead sea bream（Sparus aurata）[J].Growth Regul，1996，6：253 ～ 259.

[11]Mathers E M，Houlihan D F，McCarthy I D.Rates of growth and protein synthesis correlated with nucleic acid content in fry of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss：effects of age and temperature[J].J Fish Biol，1993，43：245～263.

[12]Perez-Sanchez J.Ration size and protein intake affect circulating growth hormone concentration，hepatic growth hormone binding and plasma insulin like growth factor-I immunoreactivity in a marine teleost，the gilthead sea bream[J].J Nutr，1995，125：546 ～ 552.

[13]Smith C E，Birn M，Halber J E.Biochemical，physiological and pathological changes in pyridoxine deficient rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） [J].J Fish Res Bd Can，1974，31（1）：1893 ～ 1898.

[14]Tsai O，Madsen S S，McCormick S D，et al.Endocrine control of cartilage in coho salmon：GH influence in vivo on the response to IGF-I in vitro[J].Zool Sci，1995，11： 299 ～ 303.