楊子彬 李善華 張龍飛 馮俊霞 李合華

核因子（NF）-κB是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其廣泛存在于各種細(xì)胞中，參與免疫應(yīng)激、細(xì)胞增殖、生長分化及細(xì)胞凋亡。NF-κB通常與其抑制蛋白IκB相結(jié)合，以非活性狀態(tài)儲存于細(xì)胞質(zhì)中，只有當(dāng)激活I(lǐng)κB激酶（IKK），水解IκB，解除了IκB的抑制作用，NF-κB才能進(jìn)入細(xì)胞核中并與相應(yīng)靶基因上的DNA序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄功能。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子-3（Tim-3）蛋白特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞表面并參與自身免疫疾病的發(fā)病，也參與腫瘤免疫[1]。為進(jìn)一步探討IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3在腫瘤患者體內(nèi)之間的關(guān)系，本研究檢測了IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3 mRNA水平，并分析這些指標(biāo)之間的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月—9月在我院腫瘤內(nèi)科接受化療的中晚期腫瘤患者32例（腫瘤組），男17例，女15例，平均（57.7±12.6）歲。其中肺癌16例，胃癌4例，乳腺癌2例，結(jié)腸癌3例，直腸癌、食管癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、血管母細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤各1例。選擇同期在我院進(jìn)行體檢的健康人群34例（對照組），其中男19例，女15例，平均（44.0±11.0）歲。2組性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.510，P>0.05），腫瘤組年齡大于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.147，P<0.01）。

1.2 儀器和試劑 實(shí)時定量PCR儀（ABI 7300）、臺式高速離心機(jī)（Sigma），TRIzol總RNA提取試劑、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒及Real Master Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）、人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)IκBα、IKKα和IKKβ的引物 。IκBα：上游 5′-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3′ ，下游5′-GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3′；IKKα：上游5′-AAACCA GAAAATTGTTGTGGACTTAA-3′，下游5′-ATCGAATCCCAG ACCCTATATCAC-3′；IKKβ：上游5-CCGACAGAGTTAGCAC GACA-3′，下游5′-GGCAATCTGCTCACCTGTTT-3′。Tim-3引物由天津潤泰科技發(fā)展有限公司設(shè)計(jì)，上游5′-TCTTTGGCCA ACCTCCCTCCCT-3′，下游5′-TGTGAGGGTTGCTGCC5TGC T-3′；內(nèi)參照GAPDH引物：上游5′-AGCCGCATCTTCTTTT?GCGTCG-3′，下游5′-TGACCAGGCGCCCAATACGA-3′。

1.4 外周血淋巴細(xì)胞分離 采集空腹肘正中靜脈血2 mL，EDTA抗凝，利用人淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。PBS洗滌2遍備用。

1.5 RNA提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 于淋巴細(xì)胞中加入1 mL TRIzo（l北京天根生化科技有限公司），破解細(xì)胞，加入氯仿，抽提水相中的總RNA；使用Quant cDNA第一鏈試劑盒按照說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：取上述總RNA 4 mL（約2 mg），Oli?go-dT15（10 mmol/L）2 mL，10×RT mix 2 mL，dNTP 混合液（2.5 mmol/L）2 mL，Quant Reverse Transcriptase 1 mL，無酶水9 mL，總計(jì)20 mL；徹底混勻，37 ℃ 1 h。

1.6 實(shí)時定量PCR 20 mL PCR反應(yīng)體系：上述cDNA 1 mL，上下游引物各1 mL，2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9 mL，無酶水8 mL；實(shí)時定量PCR反應(yīng)條件：94℃1 min預(yù)變性，94℃ 20 s變性，58℃ 15 s復(fù)性，68℃ 30 s延伸，重復(fù)40個循環(huán)?！鰿t=Ct目的基因-CtGAPDH后，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)化的2-△Ct值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，正態(tài)分布資料采用±s表示，行t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用中位數(shù)和四分位間距M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)（Wilcox?on法），相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達(dá)水平比較 腫瘤組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達(dá)水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

表 1 2組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達(dá)水平比較M（P25，P75）

2.2 腫瘤患者IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之間的相關(guān)性分析 IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之間均呈正相關(guān)（P<0.01），見表2。

表2 腫瘤患者4項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù) （rs）

3 討論

IκBs作為NF-κB的的抑制蛋白，能和NF-κB的核定位信號域結(jié)合，從而抑制NF-κB的活性。IκBα是IκBs的最主要成員之一，是NF-κB的主要調(diào)控蛋白[3]。IKK是IκB的激酶，主要由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。其中IKKα、IKKβ具有激活I(lǐng)κB的功能，而IKKγ不含催化激酶結(jié)構(gòu)，沒有激活I(lǐng)κBα的功能。IKKβ/NF-κB途徑稱為經(jīng)典途徑，而IKKα/NF-κB途徑稱為旁路途徑。IKKα和IKKβ對IκB激活作用是以IKKβ為主要成分[3]。多數(shù)惡性腫瘤發(fā)病與IKK途徑被激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示腫瘤患者的IκBα、IKKα、IKKβ mRNA表達(dá)均低于對照組，并且IκBα與IKKα、IKKβ相關(guān)系數(shù)分別是0.418和0.729，說明IκBα主要是由IKKβ激活。IKKα也參與了IκB激活，形成腫瘤，與文獻(xiàn)[4]有相同的認(rèn)識。

Tim基因家族有調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答作用。Tim-3蛋白特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞表面，可以作為區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞的標(biāo)志，有抑制Th1細(xì)胞免疫功能的作用并參與腫瘤免疫[1]。Tim基因家族蛋白是炎癥關(guān)鍵調(diào)控因子。在Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，Tim-3分子通過和Tim-3配體（Galectin-9，Tim-3L）相互作用而發(fā)揮作用。Tim-3在腫瘤免疫中通過Galectin-9促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟來增強(qiáng)免疫應(yīng)答[5]，通過活化巨噬細(xì)胞等途徑間接激活T細(xì)胞[6]。但也有人認(rèn)為可溶性Tim-3能顯著降低T細(xì)胞的抗腫瘤免疫，具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[7]。Tim-3表達(dá)量的升高會抑制機(jī)體的抗腫瘤能力，促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)展[8]。本研究結(jié)果顯示腫瘤患者的 Tim-3 mRNA 較對照組降低，且 Tim-3與 IκBα、IKKα、IKKβ均呈正相關(guān)。提示腫瘤患者的免疫功能與IKKα的相關(guān)性更為密切，Tim-3在腫瘤患者中發(fā)揮著正性調(diào)節(jié)作用[8]。

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