鄭仁省

(河北省冀州市醫(yī)院中醫(yī)科，河北 冀州 053200)

調(diào)營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血細(xì)胞因子的影響※

鄭仁省

(河北省冀州市醫(yī)院中醫(yī)科，河北 冀州 053200)

目的觀察調(diào)營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血細(xì)胞因子的影響。方法將168只清潔級昆明小鼠，隨機分為正常組、模型組、調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當(dāng)歸補血湯組，每組24只。正常組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL腹腔注射，其余各組予注射用環(huán)磷酰胺(CTX)100 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d。實驗第4 d，調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當(dāng)歸補血湯組分別給予相應(yīng)藥液0.2 mL灌胃，正常組、模型組予等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)10 d。分別于實驗第4、7、10 d取小鼠眼球血，測外周血白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)。同時，第7 d采用放射免疫分析法檢測血液中促紅細(xì)胞生成素(EPO)，之后取各組小鼠右側(cè)股骨，采用免疫組化法觀察粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)平均光密度值。結(jié)果實驗第4、7 d模型組及各藥物組WBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第10 d，模型組、調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組及當(dāng)歸補血湯組WBC均低于正常組(P＜0.05)。模型組各時間RBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第4 d，調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組及八珍湯組WBC較模型組升高(P＜0.05);調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組RBC與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗第7 d，調(diào)營飲組、八珍湯組WBC與模型組比較均明顯升高(P＜0.05);調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組RBC高于模型組(P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組WBC、RBC與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且調(diào)營飲組WBC高于調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組和當(dāng)歸補血湯組 (P＜0.05)，調(diào)營飲組RBC高于其他各用藥組(P＜0.05)。模型組EPO高于正常組(P＜0.05)，GM－CSF平均光密度值低于正常組(P＜0.05)。各用藥組EPO、GM－CSF平均光密度值與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且調(diào)營飲組EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各藥物組(P＜0.05)。結(jié)論調(diào)營飲可明顯提高化療致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表達，從而改善外周血細(xì)胞狀況，促進骨髓造血功能恢復(fù)。

骨髓疾病;疾病模型，動物;環(huán)磷酰胺;中藥療法;造血系統(tǒng)

骨髓抑制是化療常見的副作用。目前，西醫(yī)學(xué)常采用口服升白藥物(如利血生、鯊肝醇、維生素B4等)，輸注成分血或進行造血干細(xì)胞移植。但這些方法作用短暫且價格昂貴不易推廣。為此，我們運用中醫(yī)理論，根據(jù)骨髓抑制的臨床表現(xiàn)，并結(jié)合臨床實踐，創(chuàng)制了具有滋腎填精、健脾益氣兼活血養(yǎng)血功效的中藥方調(diào)營飲。本研究通過對骨髓抑制小鼠予調(diào)營飲干預(yù)，以探討調(diào)營飲對骨髓抑制小鼠造血細(xì)胞因子的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠168只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:803103。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。

1.1.2 實驗試劑及儀器 注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(山西普德藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023686)200 mg加0.9%氯化鈉注射液配制成濃度10 mg/mL溶液，第一抗體粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)兔抗IgG多克隆抗體(博士德公司)，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)放免試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)，第一抗體SP 9001試劑盒及DAB顯色劑(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 實驗藥物 調(diào)營飲:熟地黃25 g，山茱萸10 g，山藥 30 g，黃芪 10 g，當(dāng)歸 10 g，雞內(nèi)金 10 g，黃精 10 g，何首烏10 g，丹參10 g，雞血藤10 g。調(diào)營飲拆方:調(diào)營飲減丹參、雞血藤。六味地黃湯:熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，茯苓9 g，牡丹皮 9 g，澤瀉 9 g。八珍湯:當(dāng)歸 10 g，川芎5 g，白芍藥8 g，熟地黃 15 g，人參 3 g，白術(shù) 10 g，茯苓8 g，甘草5 g。當(dāng)歸補血湯:黃芪30 g，當(dāng)歸6 g。以上生藥均同一批購自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中藥房。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將實驗動物隨機分為7組，即正常組、模型組、調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當(dāng)歸補血湯組，每組24只，雌雄各半。

1.2.2 動物模型制備 昆明小鼠常規(guī)飼養(yǎng)5 d后，參照王德俊等［1］方法進行模型制備。正常組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL腹腔注射，其余各組予CTX 100 m g/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d。

1.2.3 藥物制備 分別將調(diào)營飲、調(diào)營飲拆方、六味地黃湯、八珍湯及當(dāng)歸補血湯按中藥湯劑煎煮方法煎煮濃縮，配制成濃度分別為 4.50、3.83、2.50、2.13、1.20 g/mL 湯劑，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 給藥方法 CTX腹腔注射4 h后，調(diào)營飲組、拆方組、六味地黃組、八珍湯組及當(dāng)歸補血湯組分別給予相應(yīng)藥液0.2 mL灌胃，正常組和模型組予等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)10 d。由于注射CTX后導(dǎo)致小鼠骨髓抑制，實驗第5 d，模型組、六味地黃湯組各有1只小鼠死亡，6 d八珍湯組死亡2只，8 d當(dāng)歸補血湯組死亡1只，此5只小鼠不納入統(tǒng)計。

1.2.5 標(biāo)本采集 分別于實驗后第4、7、10 d給藥6 h后，各組隨機取小鼠6～8只，摘眼球取血20 μL，用Sysmex－800自動血球計數(shù)儀自動檢測外周血白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)。同時，第7 d采用放射免疫分析法檢測血液中EPO，之后取各組小鼠右側(cè)股骨，采用免疫組化法觀察GM－CSF平均光密度值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析法檢驗;組間比較采用SNK－q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間RBC比較 見表1。

表1 各組不同時間RBC比較×1012/L，±s

表1 各組不同時間RBC比較×1012/L，±s

與正常組同期比較，*P ＜0.05;與模型組同期比較，△P ＜0.05;與調(diào)營飲組同期比較，#P ＜0.05

組 別 實驗第4 d 實驗第7 d 實驗第10 d正常組10.99 ±1.09 10.78 ±1.07 10.63 ±1.08模型組 9.25 ±.84* 6.00 ±0.59* 7.05 ±0.60*調(diào)營飲組 9.36±0.96 7.88±.90△ 10.94±1.07△調(diào)營飲拆方組 10.56±0.82△ 7.54±0.79△ 9.61±0.82△#六味地黃湯組 10.55 ±0.76△ 6.86 ±0.91 7.98 ±0.62△#八珍湯組 9.28 ±.03 7.02 ±0.78 8.07 ±0.77△#當(dāng)歸補血湯組 9.31 ±0.86 6.35 ±0.62 8.77 ±0.75△#

由1可見，模型組各時間RBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第4 d，調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組RBC與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗第7 d，調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組RBC高于模型組 (P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組RBC均明顯回升(P＜0.05)，且調(diào)營飲組高于其他各藥物組(P＜0.05)。

2.2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較 見表2。

表2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較±s

表2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較±s

與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與調(diào)營飲組比較，#P ＜0.05

組 別 n EPO(ng/mL) GM－CSF 平均光密度值正常組 8 0.53 ±0.13 0.14 ±0.02模型組 7 1.28 ±0.27* 0.08 ±0.01*調(diào)營飲組 8 1.92±0.25△ 0.21±0.02△調(diào)營飲拆方組 8 1.68 ±0.16△# 0.18 ±0.02△#六味地黃湯組 7 1.65 ±0.22△# 0.17 ±0.02△#八珍湯組 6 1.57 ±0.14△# 0.15 ±0.03△#當(dāng)歸補血湯組 8 1.54 ±0.20△# 0.13 ±0.03△#

由表2可見，模型組EPO高于正常組(P＜0.05)，GM－CS平均光密度值低于正常組(P＜0.05)。各用藥組EPO、GM－CSF平均光密度值與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且調(diào)營飲組EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各藥物組(P＜0.05)。

2.3 各組不同時間WBC比較 見表3。

表3 各組不同時間WBC比較×109/L，±s

表3 各組不同時間WBC比較×109/L，±s

與正常組同期比較，*P ＜0.05;與模型組同期比較，△P ＜0.05;與調(diào)營飲組同期比較，#P ＜0.05

組 別 實驗第4 d 實驗第7 d 實驗第10 d正常組8.53 ± 0.57 8.01 ± 0.67 8.70 ± 0.74模型組 3.13 ± 0.42* 3.51 ± 0.97* 3.99 ± 0.46*調(diào)營飲組 4.11 ± 0.59＊△ 5.09 ± 0.81＊△ 8.91 ± 0.96△調(diào)營飲拆方組 3.94 ± 0.60＊△ 4.10 ± 0.59* 6.10 ± 0.52＊△#六味地黃湯組 3.81 ± 0.43* 4.06 ± 0.49* 6.35 ± 0.39＊△#八珍湯組 4.26 ± 0.82＊△ 4.63 ± 0.56＊△ 8.21 ± 0.46△當(dāng)歸補血湯組 3.84 ± 0.63* 4.15 ± 0.62* 5.90 ± 0.60＊△#

由表3可見，實驗第4、7 d模型組及各藥物組WBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第10 d，模型組、調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組及當(dāng)歸補血湯組WBC均低于正常組(P＜0.05)，而調(diào)營飲組及八珍湯組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實驗第4 d，調(diào)營飲組、調(diào)營飲拆方組及八珍湯組WBC較模型組升高(P＜0.05)。實驗第7 d，調(diào)營飲組、八珍湯組WBC與模型組比較均明顯升高(P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組WBC與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);調(diào)營飲拆方組、六味地黃湯組、當(dāng)歸補血湯組WBC均低于調(diào)營飲組(P＜0.05)，而八珍湯組與調(diào)營飲組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

3 討論

CTX為是臨床常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。其作用機制為細(xì)胞周期非特異性藥物。在體外無抗癌效果，需在體內(nèi)經(jīng)肝微粒體混合功能氧化酶活化后，產(chǎn)生具有烷化活性的磷酰胺氮芥，發(fā)揮其細(xì)胞毒作用［2］。骨髓抑制為其主要的不良反應(yīng)之一，表現(xiàn)為WBC、RBC減少，嚴(yán)重時全血細(xì)胞減少。故本實驗采用CTX腹腔注射，復(fù)制骨髓抑制模型，操作方法簡單，重復(fù)性好。WBC、RBC能直接反映機體血液細(xì)胞的情況，間接反映骨髓造血功能及藥物對骨髓造血功能的影響，可作為評價藥物對造血功能影響的重要指標(biāo)。

骨髓紅系細(xì)胞的正常分裂、分化和成熟受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，其中EPO發(fā)揮關(guān)鍵性作用。EPO主要是由腎臟近曲小管細(xì)胞和腎皮質(zhì)、外層髓質(zhì)的小管周圍毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種具有生物學(xué)效能的糖蛋白，與集落刺激因子(CSF)和白細(xì)胞介素(IL)相比，EPO作用的細(xì)胞譜系最具特異性。EPO能特異性刺激紅系造血細(xì)胞的生長、分化和增殖［3］，從而促進WBC生成。本實驗小鼠經(jīng)CTX腹腔注射后，外周血RBC明顯低于正常組，而EPO卻高于正常組，推測可能是CTX腹腔注射導(dǎo)致小鼠貧血，反射性的促進了EPO的合成所致。GM－CSF是由激活的T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的一種糖蛋白，對早期造血祖細(xì)胞具有廣泛增殖、促進活性作用。同時，GMCSF有種屬特異性，主要作用于髓系祖細(xì)胞，通過與其高親和力受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，使其迅速進入細(xì)胞周期向粒系及巨噬系分化，最后成為成熟細(xì)胞，并能延長成熟細(xì)胞的壽命，增強成熟細(xì)胞的功能［4］。重組人GM－CSF已廣泛運用于臨床，常用于治療癌癥化療所致的骨髓抑制、再生障礙性貧血及白細(xì)胞減少癥等［5］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，化療所致的骨髓抑制屬中醫(yī)學(xué)血虛、虛勞范疇，病機為腎虛精虧，脾虛兼血瘀。治宜滋腎填精，健脾益氣，養(yǎng)血活血［6］。調(diào)營飲重用熟地黃補腎養(yǎng)血，益精填髓，培補先天，為君藥;山藥、黃芪、當(dāng)歸健脾益氣補血以培后天，山茱萸、黃精、何首烏補益肝腎精血，以合乙癸同源，精血互生之理，達先后天同治，脾腎共補，氣血共調(diào)之目的，為臣藥;雞內(nèi)金健脾消食，以助運化，丹參、雞血藤養(yǎng)血活血，祛瘀生新，以助氣血化生，為佐藥。諸藥配伍，有滋腎填精健脾益氣，兼活血養(yǎng)血功效。實驗研究證明，調(diào)營飲可改善化療所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細(xì)胞，促進骨髓造血功能恢復(fù)及增強免疫功能［6－7］。

本實驗結(jié)果表明，調(diào)營飲可明顯提高化療致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表達，從而改善外周血細(xì)胞狀況，促進骨髓造血功能恢復(fù)。

(指導(dǎo)老師:劉亞嫻)

［1］王德俊，盛樹青，李瑞琴，等.螺旋藻多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的實驗研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2001，6(1):46－48.

［2］周際昌.實用腫瘤內(nèi)科學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:234－235.

［3］中華內(nèi)科雜志編委會.全國造血生長因子與細(xì)胞因子在血液病的應(yīng)用研討會紀(jì)要［J］.中華內(nèi)科雜志，1994，33(5):336－338.

［4］尉達民，王良緒，陳萍生，等.rhIL－6，rhGM－CSF和rhEPO對人造血干細(xì)胞的作用［J］.中華內(nèi)科雜志，1994，33(5):298－301.

［5］陳陵，鄒霓，段美華.造血生長因子的臨床應(yīng)用［J］.中國實用兒科雜志，1996，11(4):241－242.

［6］鄭仁省.調(diào)營飲對化療所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細(xì)胞的影響［J］.河北中醫(yī)，2011，33(1):104－108.

［7］鄭仁省，劉亞嫻.調(diào)營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血調(diào)控的影響［J］.中醫(yī)藥通報，2010，9(6):57－60.

Investigation of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression

ZHENG Rensheng.Department of Traditional Chinese Medicine，Hebei Jizhou Hospital，Hebei，Jizhou053200

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－ induced bone marrow suppression.Methods168 mice were randomly seven groups，control group，model group，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group.There were 24 mice in each group.Control group

intraperitoneal injection of 0.9%sodium chloride injection 0.2 mL，the rest of the group received intraperitoneal injection of cyclophosphamide(CTX)100 mg/kg，once a day，continuous 3 days.Experiment No.4 d，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group were given 0.2 mL of corresponding liquid fed，the normal group and model group were given equal volume of distilled water，once a day，continuous 10 d.White blood cell count(WBC)and red blood cell count(RBC)in peripheral blood from eye of mice blood at experiment No.4，7 and 10 d.while blood erythropoietin(EPO)were detected by radioimmunoassay at the first 7 d.Mean optical density value of GM－CSF from the right femur of mice were observed using immunohistochemical staining.ResultsWBC in model group and each treatment group was lower than that in control group at experiment No.4 and 7 d(P＜0.05).WBC in model group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group was lower than that in control group at experiment No.10 d(P＜0.05).There was no significant difference between Tiaoyangyin group，Decoction of Eight Ingredients group and control group on WBC(P＞0.05).RBC in model group was lower than that in control group at difference time(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group and Decoction of Eight Ingredients group was higher than that in control group at experiment No.4 d(P＜0.05).There was significant difference between Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and model group on RBC(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group and Decoction of Eight Ingredients group was significantly increased in comparison with that in model group at experiment No.7 d(P＜ 0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on WBC and RBC at experiment No.10 d(P＜0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on EPO and mean optical density value of GM－CSF(P＜0.05).ConclusionTiaoyangyin can significantly increase GM－CSF secretion of EPO expression in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression，thereby improving the status of peripheral blood cells and promote functional recovery of bone marrow.

Bone marrow disease;Disease model;Animal;Cyclophosphamide;Therapy of traditional Chinese medicine;hemopoietic system

R－332;R730.55;R322.2;R283.661

A

1002－2619(2011)07－1055－04

※項目來源:河北省中醫(yī)藥管理局2008年度中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研計劃項目(編號:2008034)

鄭仁省(1974—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤臨床與研究。

2011－04－15)