崔敬茹 鄭榮秀 劉戈力 楊箐巖 梁東春

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們對(duì)身高的關(guān)注度越來越強(qiáng)，重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）治療矮小癥也逐漸為人們所接受[1]。生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）是生長激素（growth hormone，GH）發(fā)揮作用的中介，GHR基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致其在不同個(gè)體中的表達(dá)水平或功能上的差異。有研究表明外顯子3缺失的基因多態(tài)性可以導(dǎo)致GHR對(duì)GH反應(yīng)性的不一致，從而導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)GH治療反應(yīng)的不一致[2]，不同種族中GHR基因多態(tài)性分布不同[3]。本研究旨在了解矮小癥兒童和正常兒童GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性的分布差異，為今后探討其是否與矮小癥的發(fā)病有關(guān)，并結(jié)合臨床指標(biāo)建立可靠的GH治療預(yù)測(cè)模式奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 自 2009年9月—2010年6月于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院小兒內(nèi)分泌科就診的矮小癥患兒中選出滿足如下條件的143例作為試驗(yàn)組：（1）身高處于同年齡、同性別正常健康兒童生長曲線第3個(gè)百分位數(shù)以下或低于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD），符合矮身材標(biāo)準(zhǔn)。（2）生長緩慢，生長速率<4 cm/年。（3）骨齡落后（2.5±0.4）歲。（4）頭顱磁共振結(jié)果顯示下丘腦-垂體區(qū)無異常。其中生長激素缺乏癥（growth hormone defi?ciency，GHD）58 例，小于胎齡兒（small for gestational age，SGA）40例，特發(fā)性矮小（idopathic short stature，ISS）45例，平均年齡（9.0±2.6）歲。收集同期在我院進(jìn)行健康體檢的兒童，選取身高處于同年齡、同性別健康兒童生長曲線均值±1SD范圍的170例作為對(duì)照組，平均年齡（9.5±1.8）歲。每位自愿者取靜脈血3 mL，并簽訂知情同意書。乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 D NA提取采用天津潤泰科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的小量血液DNA提取試劑盒（產(chǎn)品代碼：GD2311-01）提取血液基因組DNA。紫外分光光度計(jì)，測(cè)定其光密度值。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物 GHR外顯子3缺失多態(tài)性的檢測(cè)參見文獻(xiàn)[4]中方法。PCR上游引物為G1：5′-TGT GCTGGTCTGTTGGTCTG-3′；下 游 2 條 引 物 分 別 為 G 2：5′-AGTCGTTCCTGGGACAGAGA-3；′ G 3 ： 5′-CCTGGATTAA CACTTTGCAGACTC-3′。PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 2.5 μL，Taq 聚合酶1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL（含基因組DNA 50 ng），dNTP（10 mmol/L）2 μL，加三蒸水14.5 μL至總體積25 μL。經(jīng)94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃條件下退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72℃延長7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下判斷結(jié)果。3種基因型fl/fl（無外顯子3缺失的純合子），fl/d3（有一條染色體缺失外顯子3的雜合子）以及d3/d3（2條染色體都缺失外顯子3的純合子）的條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根 據(jù)電泳結(jié)果條帶分布的不同計(jì)算各基因型頻數(shù)，通過公式（p+q=1，2 pq=雜合型基因頻率）計(jì)算各等位基因頻率。Hardy-Weinberg平衡公式計(jì)算各基因型的理論值（fl/fl：樣本總數(shù)×p2；fl/d3：樣本總數(shù)×2 pq；d3/d3：樣本總數(shù)×q2），χ2檢驗(yàn)檢測(cè)Hardy-Weinberg平衡吻合度。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，2組GHR基因型頻率與等位基因頻率的分布差異、不同國家和地區(qū)間基因型頻率和等位基因頻率的分布差異及組間頻率差異分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR電泳結(jié)果 fl/fl為935 bp一條帶，fl/d3為935 bp和532 bp兩條帶，d3/d3為532 bp一條帶，見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡 結(jié)果顯示，本研究所選擇人群群體代表性較好，能夠反映出2組人群一般情況（P>0.05），見表1。

表1 2組GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性基因型實(shí)際值與理論值

2.3 2組兒童GHR基因多態(tài)性分布情況 2組基因型及等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表2。

表2 2組GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性基因型分布

2.4 GHR基因型在不同國家和地區(qū)間的分布比較 將文獻(xiàn)[3，5-7]中報(bào)道的其他地區(qū)的GHR基因型與本研究中正常兒童和矮小兒童基因型的分布進(jìn)行比較,本研究（天津）、邱旭升等（江蘇）和Audi等（西班牙）研究報(bào)道的fl/fl、fl/d3、d3/d3的頻數(shù)分布及fl和d3等位基因頻率差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3。本研究與Binder等（德國）和Audi等研究中的SGA患兒基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。本研究與Jorge等（巴西）研究的GHD患兒基因型分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表3 不同地區(qū)正常人群GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性基因型分布比較

表4 不同地區(qū)SGA的GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性基因型分布比較 例（%）

表5 不同地區(qū)GHD的GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性基因型分布比較 例（%）

3 討論

3.1 GHR基因及其基因的多態(tài)性 人GHR基因位于第5號(hào)染色體的短臂上，編碼一種含有620個(gè)氨基酸的單跨膜蛋白。該基因由10個(gè)外顯子組成，外顯子1是非編碼區(qū)，外顯子2編碼信號(hào)肽，外顯子3~7編碼細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域，外顯子9和10編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。GHR基因的外顯子3、6和10在人群中存在著多態(tài)性，并可能導(dǎo)致GHR在不同個(gè)體的表達(dá)水平或功能上的差異，進(jìn)而影響GH生物學(xué)作用的發(fā)揮。發(fā)生在GHR外顯子6和10上的多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性，而編碼細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域外顯子3的多態(tài)性則是由外顯子3的保留（fl）或缺失（d3）構(gòu)成的。

3.2 GHR外顯子3缺失多態(tài)性與rhGH治療矮小癥療效的相關(guān)性 近年來，rhGH已廣泛應(yīng)用于兒科臨床，其治療矮小癥已取得了肯定的療效[7]，但接受治療的個(gè)體間卻存在著一定的療效差異。雖然許多因素可以影響rhGH治療效果，如開始治療時(shí)的年齡、身高、體質(zhì)量、骨齡、GH激發(fā)試驗(yàn)的峰值、rhGH的劑量、注射頻率、療程等，但所有這些因素只能部分解釋rhGH治療的個(gè)體差異，提示內(nèi)在的遺傳因素可能存在一定作用。在可能影響rhGH治療反應(yīng)性的基因中，GHR基因?yàn)橹匾暮蜻x基因，其外顯子3缺失多態(tài)性與rhGH治療矮小癥療效相關(guān)性的研究越來越多。雖然Carrascosa等[8]研究顯示GHR外顯子3多態(tài)性與rhGH治療效果沒有相關(guān)性，但多數(shù)如Jorge等[5]、Binder等[6]和 Audi等[7]研究結(jié)果均顯示基因型為fl/d3和d3/d3的矮小癥患者rhGH的治療效果明顯優(yōu)于基因型fl/fl的患者。此外，一項(xiàng)來自包括法國、新西蘭、英國和德國的240例SGA患兒的大規(guī)模跨國研究表明GHR外顯子3多態(tài)性與患兒對(duì)rh?GH治療的反應(yīng)有關(guān)[9]。由此推測(cè)GHR外顯子3缺失的患者可能對(duì)外源性GH治療更敏感。邱旭升等[3]及Audi等[7]報(bào)道的正常人群中d3等位基因頻率分別為0.138、0.441，而國內(nèi)目前尚鮮見GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性在矮小癥兒童和正常兒童的分布情況的報(bào)道。

3.3 不同人群GHR外顯子3缺失多態(tài)性的基因型和等位基因頻率分布 本研究顯示試驗(yàn)組GHR 3種基因型fl/fl、fl/d3、d3/d3的分布頻數(shù)分別為71、58、14例，對(duì)照組分別為110、49、11例，前者基因型為fl/d3和d3/d3的比例明顯高于后者，且d3等位基因頻率亦高于后者，而本研究與Binder、Audi、Jorge等分別研究的德國人、西班牙人、巴西人中SGA和GHD患兒GHR基因型的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)GHR外顯子3的缺失可能與矮小癥的發(fā)病有一定關(guān)系。此外，本研究（天津）與邱旭升等（江蘇）和Audi等（西班牙）研究的正常人群中GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性分布也不相同，這可以在一定程度上解釋不同地區(qū)和種族的人身高、體質(zhì)量、骨骼發(fā)育等人體測(cè)量學(xué)的差異和不同種族間生長激素治療矮小癥患者療效的不同。

綜上所述，本研究得到了GHR基因外顯子3缺失多態(tài)性在矮小癥兒童和正常兒童中的分布情況，為進(jìn)一步了解GH藥物遺傳學(xué)及矮小癥的發(fā)病機(jī)制以及將來根據(jù)基因型進(jìn)行rhGH治療個(gè)體化，改善rhGH治療效果提供了依據(jù)。

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