李厚金，謝瑩璐，邱小忠，藍(lán)文健

(1. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275；2. 南方醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，廣州 510515；3. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

軟珊瑚Sarcophytontortuosum在海南三亞珊瑚礁海區(qū)分布較廣，采集容易。我們已從該軟珊瑚中分離發(fā)現(xiàn)了一系列新的、結(jié)構(gòu)獨(dú)特的、具有抗腫瘤活性的四萜化合物methyl sartortuoate，methyl isosartortuoate，methyl tortuoate A-D[1-5]。軟珊瑚體內(nèi)共附生了大量的微生物，而共附生微生物則是潛在的活性物質(zhì)的豐富來(lái)源。

我們對(duì)Sarcophytontortuosum的內(nèi)生微生物進(jìn)行了分離培養(yǎng)，得到一批真菌和細(xì)菌。對(duì)其中的1株內(nèi)生真菌Aspergillussp.(采集編號(hào)SF005)進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)，該菌在含葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，100%海水，pH 7.5的培養(yǎng)基(GPY)中，生長(zhǎng)良好，能產(chǎn)真菌毒素青霉酸(penicillic acid)，產(chǎn)量為5.5 mg/L。當(dāng)在GPY培養(yǎng)基中添加200 mg/L的單萜α-蒎烯，能顯著促進(jìn)該真菌產(chǎn)青霉酸，產(chǎn)量可提高至29.15 mg/L。研究發(fā)現(xiàn)該菌能將α-蒎烯轉(zhuǎn)化成系列氧化產(chǎn)物，并進(jìn)一步發(fā)生氧化降解。該研究結(jié)果表明單萜α-蒎烯是一個(gè)有效的誘導(dǎo)子，能引起真菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可提高微生物次生代謝物的產(chǎn)量。

圖1 青霉酸的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

真菌Aspergillussp. (菌株編號(hào)SF005)，分離自海南三亞西島海域軟珊瑚Sarcophytontortuosum的體內(nèi)。用PDA(potato/ dextrose/ agar) + 100 %海水為培養(yǎng)基，pH 7.5，4 ℃保存。菌種保藏于中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院天然產(chǎn)物研究室。

1.2 儀器和試劑

日本島津公司高效液相色譜儀：LC20AT泵，SPD-20A檢測(cè)器。分析型色譜柱Inertsil?ODS-SP，5 μm，250 mm×4.6 mm；制備型色譜柱Shim-pack PRC-ODS，15 μm，250 mm×20 mm。美國(guó)Finnigan公司TRACE DSQ GC-MS 聯(lián)用儀。

α-蒎烯，分析純；乙腈，HPLC級(jí)，均購(gòu)于Sigma公司。乙酸乙酯為市售AR 試劑。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏為生化試劑，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

真菌Aspergillussp.發(fā)酵的GPY培養(yǎng)基配方為：葡萄糖(10 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母膏(2 g/L)、100 %海水，pH 7.5。

配制20 L GPY培養(yǎng)液，均分成2組，120 ℃滅菌20 min。接入菌種，120 r/min搖瓶室溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第5 d，在其中1組培養(yǎng)瓶中添加200 mg/L的α-蒎烯，繼續(xù)培養(yǎng)15 d。真菌培養(yǎng)液用乙酸乙酯提取3次，提取液經(jīng)低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到2種培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物提取物。

配制10 L GPY培養(yǎng)液，均分成10組，滅菌后接入真菌Aspergillussp.，培養(yǎng)至第10天，分別收集菌體，菌體分別在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接入1 L已稀釋至20%的GPY培養(yǎng)基中，同時(shí)添加200 mg α-蒎烯。每隔24 h收取1組真菌的培養(yǎng)液，用乙酸乙酯提取3次，濃縮得到不同時(shí)間條件下α-蒎烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取物。

液相色譜實(shí)驗(yàn)條件：取1 mg提取物，用2 mL乙腈溶解，進(jìn)樣5 μL。以水和乙腈為洗脫劑，以φ=30%的乙腈洗脫10 min，然后梯度提高乙腈含量，至40 min達(dá)100%，并繼續(xù)恒定至60 min。

氣質(zhì)聯(lián)用色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫：初始溫度80 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至150℃，保持10 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。 進(jìn)樣口溫度250 ℃，氦氣為載氣，流速為1 mL/min。分流比為30∶1，樣品用氯仿溶解，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子源、連接口溫度均為230 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-蒎烯對(duì)真菌Aspergillus sp.產(chǎn)青霉酸的促進(jìn)作用

真菌Aspergillussp.在GPY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，菌絲體呈白色，并能長(zhǎng)出小圓粒狀的孢子。其培養(yǎng)液為淺黃色。

10 L GPY培養(yǎng)液提取物為2.28 g，經(jīng)液相分析，青霉酸為最強(qiáng)峰，保留時(shí)間為7.2 min (見(jiàn)圖2a)，經(jīng)制備分離得到純的青霉酸為55 mg。在添加了α-蒎烯的GPY培養(yǎng)組中，10 L GPY培養(yǎng)液提取物為3.11 g，液相分析其青霉酸的保留時(shí)間也為7.2min (見(jiàn)圖2b)，經(jīng)制備分離得到純的青霉酸為291.5 mg。由此可見(jiàn)，加入α-蒎烯后可以使青霉酸的產(chǎn)量由5.5 提高到29.15 mg/L。

從其HPLC的分析結(jié)果還可以看出，在兩種培養(yǎng)條件下，其它代謝產(chǎn)物的組成和含量也具有顯著的不同。在GPY培養(yǎng)條件下，具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特性的吡嗪類(lèi)化合物[6]，如3-異丁基-6-(1-羥基-2-甲基-丙基)-2(1H)-吡嗪酮(tR=26.5 min) 和3，6-二異丁基-2(1H)-吡嗪酮(tR=28.2 min)，在添加了α-蒎烯的GPY培養(yǎng)組中并沒(méi)有檢測(cè)到。

圖2 真菌Aspergillus sp.培養(yǎng)液提取物的高效液相分析結(jié)果

2.2 真菌Aspergillus sp.對(duì)α-蒎烯的轉(zhuǎn)化

在α-蒎烯的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)組中，由于采用了稀釋的培養(yǎng)基，有效地去除了代謝產(chǎn)物的干擾。從第1～第10天的轉(zhuǎn)化提取物的GC-MS分析結(jié)果來(lái)看(第3天的結(jié)果見(jiàn)圖3)，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要為氧化產(chǎn)物(見(jiàn)圖4)。在真菌的作用下，α-蒎烯中的碳碳雙鍵易于發(fā)生環(huán)氧化；其張力相對(duì)較大的四元環(huán)也易于開(kāi)環(huán)，形成新的不飽和碳碳雙鍵，或者轉(zhuǎn)化成羥基或環(huán)氧化物。

圖3 真菌Aspergillus sp.對(duì)α-蒎烯轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖

在第1～第10天的結(jié)果分析中，仍難以描繪出各種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的變化途徑。其原因可能是各種轉(zhuǎn)化反應(yīng)同時(shí)發(fā)生的，呈多途徑，并有交叉。另外，轉(zhuǎn)化變化也是持續(xù)的，各種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都將進(jìn)一步發(fā)生開(kāi)環(huán)、降解，最終生成水溶性的小分子化合物，并有可能被真菌吸收利用。

圖4 α-蒎烯的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

3 結(jié) 論

大量報(bào)道表明，海洋微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生跟培養(yǎng)條件有很大的關(guān)系，同一菌株用不同的培養(yǎng)基可以得到完全不同的代謝產(chǎn)物。目前，人們?cè)谘芯亢Ｑ笪⑸飼r(shí)，究竟該選用何種培養(yǎng)方法，具有很大的主觀性、隨機(jī)性，而且，對(duì)于具體的微生物菌株在某種培養(yǎng)基里能產(chǎn)生何種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的代謝產(chǎn)物也無(wú)法預(yù)測(cè)。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，很多微生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量低，而且由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，也不易于人工合成，對(duì)于拿到足夠的樣品量以滿(mǎn)足藥理與臨床研究，仍有相當(dāng)困難。因此，深入研究海洋微生物的代謝規(guī)律，發(fā)展獨(dú)特的培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)可人為調(diào)控的結(jié)構(gòu)多樣的有用代謝產(chǎn)物(包括活性物質(zhì))的高效生產(chǎn)，已成為海洋微生物代謝產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)必須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

天然單萜的微生物生物轉(zhuǎn)化，能得到大量具有高附加值的含氧芳香萜類(lèi)產(chǎn)品，在日用化工行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。然而，此前的研究幾乎全是專(zhuān)注于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并未涉及到微生物的代謝產(chǎn)物變化[7-8]。真菌Aspergillussp.在GPY培養(yǎng)基中添加200 mg/L的單萜α-蒎烯，可以使青霉酸的產(chǎn)量由5.5 提高到29.15 mg/L，提高了5.3倍。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)該菌能將α-蒎烯轉(zhuǎn)化成系列氧化產(chǎn)物，并進(jìn)一步發(fā)生氧化降解。親脂性單萜可與微生物細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層作用，可改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，是“有毒的”，但由于細(xì)胞膜具有動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)能力，維持膜結(jié)構(gòu)，它能通過(guò)膜上酶活性的調(diào)節(jié)，對(duì)萜類(lèi)進(jìn)行氧化轉(zhuǎn)化，進(jìn)行“解毒”。細(xì)胞膜上的酶是復(fù)雜多樣的，它們的活性變化，尤其是氧化酶活力的增強(qiáng)，將直接影響到正常的代謝活動(dòng)，結(jié)果必將導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的組成和含量改變。本研究結(jié)果表明單萜α-蒎烯可以作為一個(gè)有效的誘導(dǎo)子，能引起微生物的過(guò)敏反應(yīng)，可提高微生物次生代謝物的產(chǎn)量。

天然單萜，資源極其豐富。微生物培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)毒、環(huán)境友好。研究單萜底物對(duì)海洋微生物代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制，并最終實(shí)現(xiàn)可人為調(diào)控的有用物質(zhì)的高效率可持續(xù)性規(guī)?；a(chǎn)，也為豐富的天然單萜資源的開(kāi)發(fā)與利用提供新的途徑和方法，無(wú)疑具有廣闊的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用前景。

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