余其鳳，周文富

(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系，福建 三明 365004)

蓮子心為睡蓮科多年生水生草本植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的成熟種子蓮子的青嫩胚芽，古名薏，味苦，性寒[1，2]。我國(guó)有著豐富的蓮子心資源，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。現(xiàn)代藥理分析證明，蓮子心具有清心安神、交通心腎、抗心律失常、保護(hù)心肌、降血壓、止血抗炎、止咳化痰、治療目赤腫痛等功效[1～6]，其主要成分為蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿、荷葉堿等多種生物堿和木犀草甙、金絲桃甙、蘆丁等黃酮類(lèi)化合物[1～12]。

黃酮類(lèi)化合物的傳統(tǒng)提取方法有冷浸法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、堿性水或堿性稀醇提取法等。近年來(lái)，微波技術(shù)發(fā)展很快，不僅可縮短萃取時(shí)間、提高萃取效率，還可降低萃取溫度，最大限度地保證萃取目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性和質(zhì)量[11～28]。

作者在此采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了蓮子心總黃酮的微波輔助提取工藝，擬為蓮子心的綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)[7，8，17]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

蓮子心，產(chǎn)自福建建寧地區(qū)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；95%乙醇；亞硝酸鈉固體；硝酸鋁固體；氫氧化鈉固體；石油醚。所用試劑均為分析純。

LWMC-205型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器，南京陵江科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司；FA1604N型電子天平、722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?；|試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；2K-82B型真空干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；800型離心沉淀機(jī)(最大轉(zhuǎn)速4000 r·min-1)，上海手術(shù)器械五廠；H.H.S型電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博經(jīng)經(jīng)貿(mào)公司；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，廈門(mén)精藝興業(yè)科技有限公司；360型FTIR紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司。

1.2 微波提取蓮子心總黃酮方法及供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g蓮子心粉末(過(guò)60目篩)于錐形瓶中，按要求加入一定量不同質(zhì)量濃度的乙醇，搖勻，將瓶口用保鮮膜封住，40℃水浴浸泡30 min后，在一定功率下微波提取一定時(shí)間，減壓抽濾，濾液定容至50 mL，搖勻，即得供試品溶液。

單因素實(shí)驗(yàn)：乙醇質(zhì)量濃度為65%、固液比為1∶25(g∶mL)、微波輻射功率為320 W、微波輻射時(shí)間為30 s、微波提取次數(shù)為3次，固定其它條件不變，依次考察上述各個(gè)因素對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響。

正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇質(zhì)量濃度、固液比、微波輻射時(shí)間和微波輻射功率作為考察因素，以提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化微波輔助提取蓮子心總黃酮的工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 微波輔助提取正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.3 分析與檢測(cè)

以蘆丁為基準(zhǔn)物，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，根據(jù)黃酮化合物母核中含有堿性氧原子，能與游離的鋁離子生成黃色絡(luò)合物，在亞硝酸鈉的堿性溶液中呈紅橙色的特性進(jìn)行比色測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱(chēng)取真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.2 mg，加入適量的65%乙醇在超聲波清洗器上超聲10 min使之溶解完全后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得0.102 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于冰箱貯存，備用。

1.3.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液顯色后(以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液的試液為參比溶液)，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～600 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液均在500 nm 處有最大吸收峰，因此選擇500 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加65%乙醇至5 mL；分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再分別加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后分別加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，并分別用65%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，在500 nm處測(cè)定吸光度。

以蘆丁含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，并進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程為：A=-2.6280×10-4+ 0.01346c，R=0.9999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 蓮子心總黃酮提取率的測(cè)定

精密吸取供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶，按1.3.3方法測(cè)定吸光度。由于75%、85%的乙醇提取液中有一定量的色素存在，測(cè)吸光度時(shí)應(yīng)先除色素，否則會(huì)影響吸光度的測(cè)定。根據(jù)回歸方程，按下式計(jì)算蓮子心總黃酮提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇質(zhì)量濃度的增大，蓮子心總黃酮提取率不斷升高；當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度增大到65%時(shí)，提取率達(dá)到最高；繼續(xù)增大乙醇質(zhì)量濃度，提取率反而降低。其原因可能與黃酮類(lèi)化合物的極性有關(guān)，不同質(zhì)量濃度的乙醇極性不同，蓮子心總黃酮的極性可能和65%乙醇的極性相當(dāng)，根據(jù)相似相溶原理，乙醇質(zhì)量濃度為65%時(shí)總黃酮的提取率最高；當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度大于65%時(shí)，提取液中會(huì)帶入色素和其它脂溶性成分，這些雜質(zhì)與黃酮類(lèi)化合物競(jìng)爭(zhēng)與乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。

2.1.2 微波輻射功率對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 微波輻射功率對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)微波輻射功率小于400 W時(shí)，蓮子心總黃酮提取率隨微波輻射功率的增大而升高。這可能是因?yàn)楫?dāng)微波輻射功率較低時(shí)，微波輻射對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用較小，分子運(yùn)動(dòng)也不劇烈，故總黃酮提取率不高；隨著微波輻射功率不斷增大，分子運(yùn)動(dòng)加劇，細(xì)胞膜破碎程度加大，另外，微波的選擇性加熱性能也起到了一定的作用，總黃酮提取率逐漸升高；但微波輻射功率太大時(shí)，細(xì)胞膜并不會(huì)無(wú)限制破碎，而微波對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的選擇性加熱性能差異則減小，一些易溶于水的物質(zhì)先被溶出，從而造成總黃酮提取率降低；此外大功率所產(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)也可能使一些黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

2.1.3 固液比對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 固液比對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著溶劑量的增大，蓮子心總黃酮提取率逐漸升高；固液比達(dá)到1∶25后，總黃酮提取率增加緩慢，逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，溶劑量較小時(shí)，蓮子心總黃酮尚未完全溶出而體系已達(dá)到飽和，因此總黃酮提取率比較低；隨著溶劑量的增大，蓮子心總黃酮不斷溶出，直至達(dá)到飽和，因此總黃酮提取率也逐漸升高；但溶劑用量過(guò)大會(huì)造成浪費(fèi)，并給提取液蒸發(fā)濃縮帶來(lái)不便。因此，溶劑用量不宜過(guò)大。

2.1.4 微波輻射時(shí)間對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響(圖5)

圖5 微波輻射時(shí)間對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，蓮子心總黃酮提取率不斷升高；但每次輻射時(shí)間超過(guò)30 s后提取率開(kāi)始下降。這是因?yàn)?，微波輻射時(shí)間過(guò)短，黃酮類(lèi)物質(zhì)還未充分溶出；隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮溶出量逐漸增大，提取率逐漸升高；繼續(xù)延長(zhǎng)微波輻射時(shí)間，未溶出的黃酮類(lèi)物質(zhì)量很少，其它雜質(zhì)可能增多，導(dǎo)致提取率下降。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響(圖6)

圖6 提取次數(shù)對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖6可知，提取次數(shù)對(duì)蓮子心總黃酮的提取率影響不大。從經(jīng)濟(jì)效益考慮，提取1次即可。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析[15](表2)

由表2可看出，各因素對(duì)蓮子心總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇質(zhì)量濃度>微波輻射時(shí)間>微波輻射功率>固液比；較優(yōu)工藝參數(shù)組合為A3B3C2D2，即乙醇質(zhì)量濃度65%、固液比1∶35(g∶mL)、微波輻射功率400 W、微波輻射時(shí)間30 s×3。

表2 微波輔助提取正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮提取效率及成本等，確定最優(yōu)工藝條件為：乙醇質(zhì)量濃度65%、固液比1∶25、微波輻射功率400 W、微波輻射時(shí)間30 s×3。在上述條件下進(jìn)行8次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，蓮子心總黃酮的平均提取率為1.021%。

此外，用石油醚萃取蓮子心提取液時(shí)，石油醚層仍呈無(wú)色透明狀態(tài)，表明65%乙醇所提取的提取液中無(wú)脂溶性色素存在。

2.3 同產(chǎn)地不同批號(hào)(日期)蓮子心總黃酮含量的比較

準(zhǔn)確稱(chēng)取3種不同批號(hào)的蓮子心粉末1 g分別置于錐形瓶中，在最佳工藝條件下微波提取，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 同產(chǎn)地不同批號(hào)蓮子心的總黃酮含量

由表3可看出，3種同產(chǎn)地不同批號(hào)蓮子心的總黃酮含量略有差異，具體原因有待進(jìn)一步探討。

2.4 不同提取方法提取效果的比較

對(duì)微波輔助提取法與乙醇浸提法、水浸提法的工藝條件及提取率進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3種提取方法提取效果的比較

由表4可看出，與傳統(tǒng)乙醇浸提法和水浸提法相比，微波輔助法提取蓮子心總黃酮的提取率高、耗時(shí)短[9]。

2.5 結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 紫外光譜分析[24～27](圖7)

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)與蓮子心提取物(b)的紫外吸收光譜

由圖7可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在240～280 nm和300～400 nm兩波帶各有一個(gè)吸收峰，蓮子心提取物在這兩個(gè)譜峰帶也有吸收且吸收帶的位置、強(qiáng)度和形狀與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品非常相似，表明蓮子心提取物的骨架和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)與蘆丁相似。

2.5.2 紅外光譜分析[19～28](圖8)

圖8 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和蓮子心提取物(b)的紅外光譜

由圖8可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與蓮子心提取物的紅外光譜圖的特征吸收峰一致：3400 cm-1為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰形寬大，吸收峰極強(qiáng)，證明有酚羥基或糖上的羥基存在；1600～1500 cm-1范圍有若干吸收峰，為苯環(huán)C-C骨架伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明有苯環(huán)存在；2930 cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，吸收峰的強(qiáng)度較小，說(shuō)明飽和碳上的氫較少；1660 cm-1左右有較強(qiáng)的吸收峰，為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰；1050 cm-1左右為C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰較強(qiáng)。這些表明蓮子心提取物含有與蘆丁相似的成分，屬于黃酮類(lèi)化合物。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定微波輔助提取蓮子心總黃酮的最優(yōu)工藝條件為：乙醇質(zhì)量濃度65%、固液比1∶25(g∶mL)、微波輻射功率400 W、微波輻射時(shí)間30 s×3，此時(shí)蓮子心總黃酮提取率達(dá)到1.021%。

(2)同產(chǎn)地不同批號(hào)蓮子心總黃酮的含量不同。

(3)微波輔助提取法與傳統(tǒng)乙醇浸提法、水浸提法相比，耗時(shí)短、提取率高，具有較好的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

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