趙 檢，王旭穎，王茂淋，鄭世學(xué)，喻子牛，張吉斌

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心，湖北 武漢 430070)

ATP：檸檬酸裂解酶(ATP：Citrate lyase，ACL，EC 2.3.3.8)廣泛存在于藻類(lèi)、植物和動(dòng)物中，在少量的原核生物或古細(xì)菌中也會(huì)存在[1]。ATP：檸檬酸裂解酶是脂肪酸合成途徑外的一個(gè)關(guān)鍵酶，能催化檸檬酸裂解生成乙酰輔酶A和草酰乙酸，從而完成脂肪酸輔酶A的合成。研究表明，當(dāng)微生物油脂積累量超過(guò)其生物量的20%時(shí)都會(huì)具有ACL活性，但尚未發(fā)現(xiàn)不同酵母和真菌中油脂積累的程度和ACL的活性具有明確的定量關(guān)系[2]。

通過(guò)對(duì)真菌基因組序列的分析表明，大部分的真菌都存在acl基因，但是在酵母菌亞門(mén)[解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)除外]中卻明顯地缺失了。在一些酵母和霉菌中ACL是由兩個(gè)基因編碼的，這兩個(gè)基因是分開(kāi)存在的，有的存在于兩個(gè)不同的染色體上，有的存在于同一染色體上不同的位置，并且它們編碼的方向也會(huì)存在差異，而在另外一些真菌和哺乳動(dòng)物體內(nèi)ACL卻是由一個(gè)基因編碼的[3]。不同菌種的ACL蛋白的結(jié)構(gòu)也不盡相同，Shashi等[4]從瘦弱紅酵母(Rhodotorulagracilis)中提取純化了ACL蛋白，研究表明該酶分子量為520 kDa，由4個(gè)120 kDa大小的亞基組成。Adams等[5]從構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中純化了ACL蛋白，該酶是一種六聚體結(jié)構(gòu)，由3個(gè)70 kDa和3個(gè)55 kDa的亞基蛋白組成。

有關(guān)acl基因的克隆研究最早始于1990年，Elshourbagy等[6]首次克隆了動(dòng)物體內(nèi)的acl基因。為了了解原核生物ACL分子水平的作用機(jī)制，Kanao等[7]對(duì)細(xì)菌的ACL作用機(jī)制進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)研究，確定了磷酸化作用位點(diǎn)、活性抑制劑等因素。所有原核、真菌、哺乳動(dòng)物和植物等的acl基因序列都包含幾個(gè)高度的保守區(qū)，這些保守區(qū)都是ACL起催化作用的位點(diǎn)，如ATP-、CoA-、草酰乙酸鹽結(jié)合位點(diǎn)以及檸檬酸合成酶作用位點(diǎn)等。Kim等[8]從綠硫菌(Chlorobiumtepidum)中克隆得到了編碼ACL兩個(gè)亞基的基因，并且將其分別在大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)中進(jìn)行了表達(dá)和酶活分析，結(jié)果表明兩個(gè)亞基對(duì)全酶的催化活性都起著重要的作用。目前還沒(méi)有克隆表達(dá)產(chǎn)油微生物acl基因的報(bào)道，因此，篩選分離出產(chǎn)油微生物的acl基因，利用基因工程實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)量的調(diào)控，提高酶活性，進(jìn)而提高微生物甚至是油料作物的產(chǎn)油能力，成為了新的研究熱點(diǎn)。

作者從高產(chǎn)油粘紅酵母中克隆ATP：檸檬酸裂解酶基因的兩個(gè)亞基基因acl1和acl2，在畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和酶活驗(yàn)證，以獲取更高的ACL酶活力，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，為提高油料作物油脂含量提供了新的轉(zhuǎn)基因材料。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

粘紅酵母 (Rhodotorulaglutinis)31596，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所；PichiapastorisGS115，自行保藏；pPICZαA表達(dá)載體由國(guó)家海洋局第三海洋研究所惠贈(zèng)；pMD18-T，Takara公司。

E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit，Omega公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPCR Cleanup Kit，Axygen公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas公司；T4 DNA連接酶及限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ、XbaⅠ、KpnⅠ和PmeⅠ)、 Ex TaqTMPolymerase、RNase A，Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

首先將甘油管內(nèi)保存的粘紅酵母劃線(xiàn)至YPD平板上長(zhǎng)出二代單菌落，然后挑取單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，待菌體長(zhǎng)到一定濃度(OD600≈1.2)后，離心收集菌體，采用E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit試劑盒提取總RNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。將提取好的RNA進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后于-80 ℃保存。

1.2.2acl1和acl2基因的擴(kuò)增

根據(jù)在NCBI中查找的和粘紅酵母親緣關(guān)系最近且同為油脂酵母的模式菌解脂耶氏酵母 (Yarrowialipolytica)CLIB122的acl基因的兩個(gè)亞基acl1 (CR382131.1)和acl2 (CR382130.1) 的序列(分析表明均無(wú)內(nèi)含子)，分別設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物：ACL1-F/ACL1-R和ACL2-F/ACL2-R，引物序列見(jiàn)表1，引物由上海英駿公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物

以提取的粘紅酵母RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，第二輪PCR體系為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。將擴(kuò)增得到的目的基因片段送上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPICZαA-acl1和pPICZαA-acl2的構(gòu)建

將擴(kuò)增得到的acl1基因片段和pPICZαA載體分別用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，acl2基因片段和pPICZαA載體分別用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，然后回收目的片段分別進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPICZαA-acl1和pPICZαA-acl2。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

將構(gòu)建好的重組載體pPICZαA-acl1和pPICZαA-acl2分別用PmeI線(xiàn)性化，然后將10～20 μL線(xiàn)性化質(zhì)粒分別加入到80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上靜置5 min，放入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯電轉(zhuǎn)(電轉(zhuǎn)參數(shù)：2.0 kV)約5 ms，然后立即加入1 mL冰浴的山梨醇，30 ℃靜置1 h，最后取100 μL轉(zhuǎn)化液，涂布YPDS (300 μg·mL-1Zeocin)平板，將YPDS板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，直至長(zhǎng)出菌落。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

篩選出陽(yáng)性克隆子后，先對(duì)其進(jìn)行小量甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況，具體操作步驟如下：挑取YPDS平板上的陽(yáng)性單克隆接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、搖床培養(yǎng)2～3 d；收集培養(yǎng)液，4 ℃、8000 r·min-1離心15 min，取沉淀(盡量將上清除盡)，向其中加入40 mL含有0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，重新在30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)；為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，每24 h補(bǔ)加甲醇，使菌液中的甲醇濃度保持在0.5%；每隔24 h取樣，4 ℃、8000 r·min-1離心15 min，收集菌體，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白；誘導(dǎo)4～5 d后，4℃、8000 r·min-1離心15 min，收集菌體，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白。然后大量表達(dá)目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用金屬(Ni2+)螯合瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，收集的純化產(chǎn)物分別以紫外分光光度法和SDS-PAGE測(cè)定蛋白濃度和純度。

1.2.6 酶活分析

ACL活性的測(cè)定采用傳統(tǒng)方法：蘋(píng)果酸脫氫酶偶聯(lián)法[9]。通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)定NADH在340 nm處吸光度的減少，確定ACL相對(duì)酶活性。

2 結(jié)果和討論

2.1 全長(zhǎng)基因的克隆及序列分析

以粘紅酵母RNA為模板通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到acl基因的兩個(gè)亞基，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得產(chǎn)物大小分別約為2.0 kb (acl1) 和1.5 kb (acl2)(圖1)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物測(cè)序，將序列結(jié)果提交NCBI通過(guò)Blast分析比對(duì)，所擴(kuò)增的acl1基因片段與GenBank中登錄的YarrowialipolyticaCLIB122 (CR382131.1)、AspergillusnigerCBS (001394018.2)、Penicilliumchrysogenum(AM920436.1)的DNA序列中的acl1基因序列同源性分別為100%、92%、73%，acl2基因片段與GenBank中登錄的YarrowialipolyticaCLIB122 (CR382130.1)、AspergillusnigerCBS(XM 001394020.2)、Magnaportheoryzae(XM 370223.1)的DNA序列中的acl2基因序列同源性分別為100%、76%、69%，表明已成功擴(kuò)增獲得粘紅酵母的acl1和acl2基因序列。通過(guò)軟件分析表明，acl1基因序列長(zhǎng)1953 bp，不含內(nèi)含子，理論蛋白分子量為71 kDa，等電點(diǎn)為8.0；acl2基因序列長(zhǎng)1494 bp，不含內(nèi)含子，理論蛋白分子量為54 kDa，等電點(diǎn)為5.6。

M. DNA Marker 1，2.粘紅酵母acl1 3，4.粘紅酵母acl2

2.2 重組載體pPICZαA-acl1和pPICZαA-acl2的構(gòu)建和鑒定

重組載體的構(gòu)建如圖2所示。將重組載體pPICZαA-acl1用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切、pPICZαA-acl2用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖3所示。

圖2 重組載體pPICZαA-acl1和pPICZαA-acl2的構(gòu)建

1，4. DNA Marker 2. Eco RⅠ和XbaⅠ雙酶切pPICZαA-acl1

由圖3可知，pPICZαA-acl1經(jīng)雙酶切產(chǎn)生約2.0 kb和3.5 kb的條帶，pPICZαA-acl2經(jīng)雙酶切產(chǎn)生約1.5 kb和3.5 kb的條帶，與預(yù)期相符。對(duì)重組子的目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，讀碼框完全正確，不存在突變位點(diǎn)。

2.3 重組蛋白的純化

對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

M.蛋白 Marker 1.純化的ACL1蛋白 2.純化的ACL2蛋白

由圖4可知，兩個(gè)亞基蛋白ACL1和ACL2的分子量分別約為66 kDa和55 kDa。純化后的ACL1和ACL2亞基蛋白的濃度分別達(dá)到1.34 mg·mL-1和1.6 mg·mL-1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

2.4 酶活檢測(cè)及最佳酶反應(yīng)條件的確定

分別對(duì)粘紅酵母的單個(gè)亞基的酶比活力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 ACL全酶和各亞基的酶比活力

由圖5可知，單個(gè)亞基進(jìn)行酶活測(cè)定時(shí)的酶比活力不到1.0 U·mg-1，說(shuō)明全酶要發(fā)揮最大作用，就必須將其兩個(gè)亞基所含有的所有催化作用位點(diǎn)都聚齊，缺失一個(gè)都會(huì)嚴(yán)重影響其酶活力。

粘紅酵母的ACL1和ACL2不同質(zhì)量比混合對(duì)酶比活力的影響見(jiàn)圖6。

m(ACL1)∶m(ACL2)

由圖6可知，ACL1和ACL2質(zhì)量比在1∶1混合時(shí)全酶的比活力達(dá)到最大，為6.5 U·mg-1，比原始酵母提高了近10%。

將兩種亞基按照最佳質(zhì)量比混合，保證一定濃度，分別考察酶反應(yīng)的pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)全酶酶比活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 反應(yīng)條件對(duì)全酶酶比活力的影響

由圖7可知，全酶的最佳反應(yīng)pH值為8.5(圖7a)，偏酸或者偏堿都會(huì)影響酶活力；最佳反應(yīng)溫度約為37 ℃(圖7b)，過(guò)高的溫度會(huì)降低酶活力，說(shuō)明該酶不耐高溫，保存的時(shí)候需要超低溫保存且時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)；最佳反應(yīng)時(shí)間約為10 min(圖7c)，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響很小。

2.5 討論

多數(shù)報(bào)道選用細(xì)菌來(lái)源的基因，表達(dá)后的ACL蛋白酶活力都比較低，如Kanao等[10]從泥生綠菌(Chlorobiumlimicola)中克隆得到aclBA進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)后蛋白的酶比活力為3.5 U·mg-1。Langlade等[11]從植物白羽扇豆(Lupinusalbus)中克隆得到aclA和aclB，并分別進(jìn)行了酵母表達(dá)，表達(dá)后蛋白的酶比活力為5.3 U·mg-1。目前還沒(méi)有克隆表達(dá)產(chǎn)油微生物acl基因的報(bào)道。本研究采用粘紅酵母作為基因克隆材料，成功克隆出acl基因，在畢赤酵母(本身不存在acl基因[12])中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，ACL蛋白的酶比活力最高達(dá)6.5 U·mg-1，比在粘紅酵母本身(比活力為5.88 U·mg-1[4])提高了近10%。結(jié)果還表明，表達(dá)后的粘紅酵母ACL酶反應(yīng)的最佳條件不同于酵母的正常生長(zhǎng)環(huán)境，且全酶要發(fā)揮最大的酶活力，其兩個(gè)亞基蛋白缺一不可。

總之，可以利用基因工程來(lái)對(duì)粘紅酵母這類(lèi)油脂酵母的acl基因表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控，并提高ACL酶活力。ACL活性的提高可能增加油菜菜籽中的油酸含量[13]，因此，油脂酵母可提供新的基因資源，并應(yīng)用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因植物，從而提高油料作物的油脂含量。

3 結(jié)論

從粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)中克隆得到ATP：檸檬酸裂解酶基因兩個(gè)亞基acl1和acl2，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)Ni柱純化目的蛋白，以實(shí)時(shí)波長(zhǎng)掃描對(duì)重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析。SDS-PAGE分析表明，兩個(gè)亞基ACL1和ACL2的分子量分別為66 kDa和55 kDa。重組蛋白的酶學(xué)測(cè)定表明：經(jīng)畢赤酵母表達(dá)后，單個(gè)亞基酶活性不到1.0 U·mg-1，雙亞基混合后具有較高的酶活性，當(dāng)混合質(zhì)量比為1∶1時(shí)全酶的酶比活力達(dá)到最大，為6.5 U·mg-1，酶反應(yīng)的最佳條件為：pH值8.5、37 ℃反應(yīng)10 min。為提高油料作物油脂含量提供了新的轉(zhuǎn)基因材料。

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