李 政，趙朝成，張?jiān)撇?，劉春爽，趙東風(fēng)

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266555)

隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油污染日益嚴(yán)重[1]。大量研究表明，生物修復(fù)技術(shù)是迄今為止處理石油污染比較好的一種方法，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)屬的耐溫菌(28～40 ℃)可利用原油或原油的某一組分為唯一碳源生長(zhǎng)，較為常見的有紅球菌屬(Rhodococcus)[3]、假單胞菌屬(Pseudomona)[4]、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)[5]等。但這類耐溫石油降解菌無法滿足極端環(huán)境如沙漠土壤、半干旱的炎熱地區(qū)和堆肥反應(yīng)體系的石油污染生物修復(fù)，因此很多學(xué)者開始研究降解原油的耐熱菌屬(40～80 ℃)。目前已報(bào)道的有嗜熱嗜油桿菌屬(Thermoleophilum)[6]、熱微菌屬(Thermomicrobium)[7]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[8]、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)[8]和棲熱菌屬(Thermus)[9]。耐熱石油降解菌的研究多集中在對(duì)原油單一組分或原油輕質(zhì)組分的降解方面[10，11]，而耐熱菌降解高濃度原油的相關(guān)研究較少。因此，針對(duì)石油污染的極端環(huán)境篩選獲得高效耐熱石油降解菌十分重要。

石油是一種復(fù)雜的混合物[12]，其生物降解必須由不同種類、不同分工的微生物協(xié)同作用才能完成[13]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究大多以純化后的單一石油降解菌株重組的復(fù)合菌為研究對(duì)象[14～16]，但各菌投加量的變化以及相互間可能存在的抑制作用都會(huì)對(duì)復(fù)合菌的降解產(chǎn)生負(fù)面影響[17]。在被石油污染的土壤中存在著一系列經(jīng)自然選擇優(yōu)化過的混合菌群[18，19]，其中不同菌株的功能通過長(zhǎng)期的演化穩(wěn)定下來。混合菌群不但有較好的原油降解效果，而且有更好的商業(yè)前景[20]，但相關(guān)報(bào)道還很少見。

作者從新疆克拉瑪依油田石油污染土壤中篩選獲得一組高效耐熱石油降解混合菌群，考察了混合菌群的組成并探討了其降解特性，以期為進(jìn)一步拓展其石油污染極端環(huán)境的生物修復(fù)功能奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

從新疆克拉瑪依油田紅山嘴油田區(qū)、車排子油區(qū)、風(fēng)城油區(qū)及百口泉油區(qū)原油處理污泥池、事故池、鉆井泥漿池及泄油池附近采集石油污染土壤。采用棋盤式五點(diǎn)采樣法，取淺層(0～20 cm)土壤，每點(diǎn)取樣量基本一致，將各點(diǎn)取來的樣品等量混合，密封備用。油樣取自克拉瑪依油田采油二廠采油井原油。

1.2 儀器

OIL-510型全自動(dòng)紅外分光測(cè)油儀，北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司；HZQ-HA型水浴振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；氣相色譜-模擬蒸餾儀，美國(guó)瓦里安；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)(g·L-1)：Na2HPO40.6，KH2PO40.2，NaNO34.0，MgSO40.3，CaCl20.01，F(xiàn)eSO40.01，酵母膏 0.5，pH值7.2～7.4。

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10.0，酵母浸出汁5.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0(固體培養(yǎng)基用)，pH值7.2～7.4。

1.4 石油降解混合菌群的富集、篩選及組成

將5 g土樣和1 g油樣加到100 mL MSM中，于45 ℃、160 r·min-1搖床恒溫培養(yǎng)5～7 d后，按5%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)，直至連續(xù)3次降解率穩(wěn)定。用20%甘油保種，于低溫冰箱保存。選擇石油降解率最高的混合菌群用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將混合菌群稀釋涂布，在平板上選擇不同形態(tài)特征的菌落，挑取單菌落劃線分純，于LB固體培養(yǎng)基斜面保存。使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)對(duì)單菌株進(jìn)行基因組DNA提取，以細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank上與已知的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定其菌屬。

1.5 石油降解混合菌群的降解性能研究

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期的混合菌群按5%接種量接種到原油濃度為10 g·L-1的100 mL MSM中，分別考察培養(yǎng)時(shí)間、氮磷比、初始pH值、原油濃度、表面活性劑濃度對(duì)原油降解率的影響。

1.6 降解原油組分分析

運(yùn)用氣相色譜-模擬蒸餾儀分析降解前后原油組分，操作條件：進(jìn)樣量1 μL；分流比(1∶2)；毛細(xì)管柱為CP5960柱(5 m×0.53 mm，0.25 μm)；柱溫：初溫35 ℃，保持2 min，10 ℃·min-1程序升溫至350 ℃，保持10 min；載氣為N2；程序升溫：進(jìn)樣口溫度20 ℃，保持0.1 min，以175 ℃·min-1程序升溫，終止溫度350 ℃；檢測(cè)器溫度350 ℃。

1.7 含油量的測(cè)定

對(duì)《水質(zhì)、石油類和動(dòng)植物油的測(cè)定-紅外光度法》(GB/T 16488-1996)稍做改進(jìn)，采用紅外分光測(cè)油儀測(cè)定原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的含油量。培養(yǎng)基中的原油經(jīng)混合菌群降解后變?yōu)槲⑿⌒躞w，萃取液通過鋪有無水Na2SO4的玻璃砂芯漏斗脫水時(shí)極易堵塞，因此采用循環(huán)水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中。同時(shí)，為了保證脫水效果，將無水Na2SO4的厚度加大，由標(biāo)準(zhǔn)中的10 mm改為15 mm。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱石油降解混合菌群的篩選及其組成

從64個(gè)土樣中篩選獲得6組以原油為唯一碳源的耐熱石油降解混合菌群，其對(duì)原油(10 g·L-1)的降解現(xiàn)象及降解率見表1。

表1 混合菌群對(duì)原油的降解現(xiàn)象及降解率

降解后菌群所在培養(yǎng)基溶液渾濁且顏色逐漸變淡者對(duì)應(yīng)的原油降解率相對(duì)較高。由表1可知，KLO-8降解效果優(yōu)于其它5組混合菌群，對(duì)濃度為10 g·L-1的原油的降解率達(dá)到55.6%。

采用稀釋涂布法從培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期的混合菌群KLO-8(5.0×1010個(gè)·mL-1)中分離獲得4株菌落形態(tài)互異的單菌，分別編號(hào)為A、B、C、D。16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見表2。

表2 16S rDNA片段序列比對(duì)信息

由表2可知，菌株A、B、C屬于芽孢桿菌(Bacillussp.)、菌株D為地芽孢桿菌(Geobacillussp.)，均為耐熱菌[8]。

2.2 KLO-8最適生長(zhǎng)溫度和最高耐受溫度的考察

溫度對(duì)石油降解菌的生長(zhǎng)影響顯著。研究表明[21]，溫度較低時(shí)，原油粘度較大，有毒短鏈烷烴揮發(fā)性較差，微生物啟動(dòng)滯后；隨著溫度的升高，烴的代謝率上升；溫度繼續(xù)升高，烴的膜毒性增大，微生物活性降低。此外，微生物的酶活性在一定溫度范圍內(nèi)才能發(fā)揮作用，不同微生物有不同的適宜生長(zhǎng)溫度。將KLO-8分別在30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃條件下160 r·min-1培養(yǎng)7 d，測(cè)定其對(duì)原油的降解效果，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度對(duì)原油降解率的影響

由圖1可知，KLO-8在45～55 ℃之間降解效果較好，原油降解率均在55%以上，其中45 ℃時(shí)原油降解率達(dá)到最高，為55.71%；在70 ℃時(shí)仍有一定的降解效果，降解率為25%；溫度超過75 ℃，原油幾乎未被降解，顯微鏡觀察無游動(dòng)菌體，推斷KLO-8在此高溫下基本喪失活性。因此，混合菌群KLO-8在原油中的最適生長(zhǎng)溫度為45～55 ℃、最高耐受溫度為75 ℃。

2.3 KLO-8的降解性能研究

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間的影響

KLO-8在45 ℃、160 r·min-1條件下，分別培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d，測(cè)定其對(duì)原油的降解效果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原油降解率的影響

由圖2可知，KLO-8在培養(yǎng)3～7 d時(shí)對(duì)原油的降解速率最大，此時(shí)微生物已經(jīng)適應(yīng)周圍的培養(yǎng)環(huán)境，原油中易被降解的組分含量較高，降解菌得以迅速生長(zhǎng)繁殖；此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，KLO-8對(duì)原油的降解速率逐漸降低，說明殘油組分越來越難以被KLO-8利用，并有可能對(duì)其形成抑制。因此，混合菌群KLO-8的最佳培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

2.3.2 氮磷比的影響

氮、磷是微生物生長(zhǎng)的必需元素，也是影響石油降解菌降解效率的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將KLO-8接種于氮磷比分別為1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1的MSM中，在原油濃度為10 g·L-1、pH值為8、45 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)定其對(duì)原油的降解效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮磷比對(duì)原油降解率的影響

由圖3可知，隨著氮磷比的增大，原油降解率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)?shù)妆葹?∶1時(shí)，降解效果較好，搖瓶中基本沒有浮油，降解率達(dá)到最高；隨著氮磷比的繼續(xù)增大，降解率開始下降。這表明，微生物的生長(zhǎng)與氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽的量存在最佳的匹配值，混合菌群KLO-8的最佳氮磷比為3∶1。

2.3.3 初始pH值的影響

選取初始pH值分別為5、6、7、8、9、10的MSM，在原油濃度為10 g·L-1、45 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)定混合菌群KLO-8對(duì)原油的降解效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 初始pH值對(duì)原油降解率的影響

由圖4可知，KLO-8在堿性條件下對(duì)原油的降解能力強(qiáng)于酸性條件下的降解能力，這與克拉瑪依油田土壤偏堿性有關(guān)。KLO-8在pH值8附近降解率達(dá)到最大，為55.82%。這是因?yàn)?，pH值過低時(shí)，氫離子濃度超過微生物酶的適應(yīng)范圍，使微生物原生質(zhì)膜的電荷改變；而pH值過高又會(huì)對(duì)降解菌的生長(zhǎng)和降解酶的分泌產(chǎn)生不利影響，最終影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶的活性。因此，混合菌群KLO-8生長(zhǎng)的最佳初始pH值為8。

2.3.4 原油濃度的影響

在以上優(yōu)化條件下，將KLO-8分別在原油濃度為2 g·L-1、4 g·L-1、6 g·L-1、8 g·L-1、10 g·L-1、12 g·L-1、14 g·L-1、16 g·L-1下培養(yǎng)7 d，以考察原油濃度對(duì)降解效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 原油濃度對(duì)原油降解率的影響

由圖5可知，當(dāng)原油濃度低于10 g·L-1時(shí)，KLO-8對(duì)原油有較好的降解效果，降解率均在50%以上；當(dāng)原油濃度高于10 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基表層的油膜厚度增大，影響氧氣的傳遞，使得KLO-8因缺氧而無法生長(zhǎng)繁殖，并且原油濃度過高會(huì)對(duì)KLO-8產(chǎn)生毒害作用，還會(huì)導(dǎo)致碳氮磷比例失衡，氮磷濃度相對(duì)不足，不能滿足微生物降解原油的需要，均使得原油降解率大幅降低。因此，混合菌群KLO-8的適宜原油濃度不高于10 g·L-1。

2.3.5 表面活性劑濃度的影響

表面活性劑具有親水和親油基團(tuán)，可以促進(jìn)石油乳化，防止油水之間的相互排斥，并具有使其相互作用的功能。陰離子表面活性劑的加入能夠改進(jìn)憎水性有機(jī)化合物的親水性和生物可利用性，有利于微生物降解碳?xì)浠衔?。在MSM中加入十二烷基苯磺酸鈉，濃度分別為0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1，在原油濃度為10 g·L-1、pH值為8、氮磷比為3∶1、45 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)定混合菌群KLO-8對(duì)原油的降解效果，結(jié)果如圖6所示。

圖6 表面活性劑濃度對(duì)原油降解率的影響

由圖6可知，添加一定濃度的陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉對(duì)原油降解有促進(jìn)作用。當(dāng)添加濃度為50 mg·L-1時(shí)，KLO-8對(duì)原油的降解率提高19.1%，但隨著表面活性劑濃度的增加降解效果明顯下降。這說明十二烷基苯磺酸鈉的毒性作用雖然相對(duì)較小，但含量過高時(shí)仍會(huì)對(duì)混合菌群的生長(zhǎng)和活性產(chǎn)生抑制作用，從而影響培養(yǎng)基中原油的降解。因此，十二烷基苯磺酸鈉的最佳添加濃度為50 mg·L-1。

2.4 混合菌群降解原油組分分析

運(yùn)用氣相色譜-模擬蒸餾儀分析降解前后原油中的正構(gòu)烷烴，結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 降解前后原油組分氣相色譜圖

圖8 原油中正構(gòu)烷烴的降解

由圖7、圖8可知：(1)KLO-8能夠利用原油中C11～C37的正構(gòu)烷烴，并且隨著碳原子數(shù)的增加對(duì)原油中正構(gòu)烷烴的利用率降低；(2)高溫滅菌及樣品處理過程中輕組分丟失導(dǎo)致原油中C11之前的組分未顯示；(3)短鏈烷烴C11～C15幾乎全部被利用，降解率在95%以上；(4)C17～C19間組分的降解效果較差，原因在于其在降解前原油中含量相對(duì)較高，并且高分子量組分的降解可能會(huì)導(dǎo)致C17～C19的積累；(5)C20～C25的降解效果較好，降解率在65%以上；(6)KLO-8能夠利用長(zhǎng)鏈烷烴，C37降解率為24.75%；(7)降解后原油中C14、C16、C33、C34和C35沒有顯示，原因可能是這些組分異構(gòu)化，儀器檢測(cè)不出。

3 結(jié)論

(1)從克拉瑪依油田石油污染土壤64個(gè)樣品中篩選獲得6組耐熱石油降解混合菌群，其中KLO-8對(duì)原油的降解效果最佳,對(duì)濃度為10 g·L-1的原油的降解率達(dá)到55.6%。KLO-8包含4株耐熱降油菌，16S rDNA序列分析鑒定表明其中3株為芽孢桿菌(Bacillussp.)、1株為地芽孢桿菌(Geobacillussp.)。KLO-8最適生長(zhǎng)溫度為45～55 ℃、最高耐受溫度為75 ℃。

(2)通過單因子實(shí)驗(yàn)考察了培養(yǎng)時(shí)間、氮磷比、初始pH值、原油濃度和表面活性劑濃度對(duì)KLO-8降解特性的影響。結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)時(shí)間為7 d；最佳氮磷比為3∶1；初始pH值偏堿性更利于原油的降解，最佳初始pH值為8；原油濃度不高于10 g·L-1時(shí)降解效果較好；添加表面活性劑(十二烷基苯磺酸鈉)能夠提高降解效果，最佳添加濃度為50 mg·L-1。

(3)運(yùn)用氣相色譜-模擬蒸餾儀分析KLO-8對(duì)原油中正構(gòu)烷烴的降解，結(jié)果表明混合菌群對(duì)C11～C37之間的正構(gòu)烷烴均有一定的降解效果，隨著碳原子數(shù)的增加KLO-8對(duì)原油中正構(gòu)烷烴的利用率逐漸降低。其中C11～C15的組分幾乎全部降解，長(zhǎng)鏈烷烴C37降解率為24.75%。

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