楊亞萍，劉 濤，陳家樹，林 熙

(1.暨南大學(xué)分析測(cè)試中心，廣東廣州 510632;2.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080;3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東廣州 510632)

蛇毒中除了含有多種致命的神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素外，還含有許多作用于人凝血-纖溶系統(tǒng)的蛋白酶和活性多肽［1－2］。尖吻蝮蛇，又稱五步蛇，是我國(guó)特有的劇毒蛇種，分布廣泛，資源豐富，富含纖溶成分。Liang等［3］已從安徽產(chǎn)五步蛇毒中提取出纖溶酶FⅡa，該組分具有無出血活性，分子量低，纖溶活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其基因工程產(chǎn)品亦具有廣闊的應(yīng)用前景。但該蛇毒中是否還存在更具開發(fā)價(jià)值的纖溶組分，尚不得而知。本研究選用安徽產(chǎn)五步蛇毒干粉，著力于該蛇毒中另一纖溶組分FⅨ的研究，試圖從中分離純化出一種分子量更低，活性更強(qiáng)的新纖溶組分，并對(duì)其生化特征和生物學(xué)活性等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 五步蛇(安徽產(chǎn))粗毒凍干粉由廣州醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供;DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-75、Sephadex G-50(美國(guó) Parmacia Biotech);Chelating Sepharose Fast Flow(美國(guó)Amersham Bioscience);人凝血酶(珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)生物化學(xué)制藥廠);牛纖維蛋白原、纖溶酶、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(美國(guó) Sigma Aldrich);尿激酶(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司);昆明系小鼠30只(粵檢證字05A064)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器 可見/紫外分光光度計(jì)、微型雙垂直板電泳槽、恒壓恒流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)，J-21型高速離心機(jī)(美國(guó) Beckman)，電子天平(德國(guó)Sartorius)，真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)labconco)，凝膠成像設(shè)備(英國(guó) UVI-tech公司)，BS-100A自動(dòng)部分收集器、BS-160A自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠)，凝膠成像設(shè)備(英國(guó) UVI-tech公司)。

1.3 方法

1.3.1 五步蛇(安徽產(chǎn))粗毒的分離純 DEAESephadex A-50陰離子交換層析:取1.0 g五步蛇(安徽產(chǎn))粗毒溶于4 ml的50 mmol·L－1(pH 8.0)的乙酸銨緩沖液中，低溫離心去沉渣后取上清液。上清液裝入用同樣緩沖液平衡的DEAE-Sephadex A-50陰離子交換層析柱(2.6 cm×80 cm)，洗脫約1 000 ml后，改用 50 mmol·L－1(pH 8.0)和 1.0 mmol·L－1(pH 8.0)的乙酸銨緩沖液各750 ml作直線梯度洗脫，流速 12 ml·h－1［4］。Sephadex G-75凝膠層析:將DEAE-Sephadex A-50離子交換層析得到的纖溶活性組分30 mg溶于1.5 ml以上50 mmol·L－1(pH 8.0)的乙酸銨緩沖液平衡的Sephadex G-75凝膠層析柱 (1 cm×150 cm)，流速6 ml·h－1［5］。Chelating Sepharose Fast Flow 金屬離子螯合親和層析:取Sephadex G-75凝膠過濾得到的纖溶活性組分20 mg溶于含50 mmol·L－1NaCl的50 mmol·L－1(pH 7.0)Na2HPO4溶液平衡的 Chelating Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析柱(1.6 cm×30 cm)，待洗脫約5倍柱床體積后，換用不同pH的上述緩沖液各100 ml作 (pH 7.0～2.0)直線梯度洗脫，流速 36 ml·h－1［6］。Sephadex G-50 凝膠層析:將Chelating Sepharose Fast Flow金屬離子鰲合層析得到的纖溶活性組分20 mg溶于50 mmol·L－1(pH 8.0)的乙酸銨緩沖液平衡的Sephadex G-50凝膠層析柱(1 cm ×150 cm)，流速6 ml·h－1。以上洗脫液均在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。

1.3.2 SDS-PAGE電泳 采用 SDS-PAGE垂直平板式電泳［7］，分離膠濃度為12%，pH 8.8;濃縮膠濃度為4%，pH 6.8;電極緩沖液采用Tris-甘氨酸，電壓100 V，待指示劑進(jìn)入分離膠后改恒壓200 V，電泳時(shí)間為1 h。

1.3.3 分子量及等電點(diǎn)測(cè)定 用Auto Flex MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜儀檢測(cè)纖溶酶的分子量。等電聚焦電泳儀檢測(cè)纖溶酶的等電點(diǎn)。

1.3.4 FⅨcaⅠ降解纖維蛋白(原)活性的分析

1.3.4.1 FⅨcaⅠ降解纖維蛋白原的作用 用0.1 mol·L－1(pH 7.8)Tris-HCl緩沖液配制濃度為1 g·L－1的牛維蛋白原溶液，取 0.5 g·L－1的 FⅨcaⅠ0.15 ml加入牛維蛋白原溶液450 μl中，于37℃溫育。分別在 1、5、15、30 min、1、2、8、24 h 各取 20 μl的反應(yīng)液，立即加入5 μl的等量的電泳上樣緩沖液，100℃水浴3 min，以4%的濃縮膠和12%分離膠作 SDS-PAGE［8］。同樣以 500 U·L－1的人纖溶酶0.15 ml作對(duì)照。

1.3.4.2 FⅨcaⅠ降解纖維蛋白的作用 采用纖維蛋白平板法［9］。取20 μl不同濃度的纖溶酶FⅨcaⅠ于平板表面，每一樣品加3點(diǎn)，37℃保溫24 h，觀察透明圈的形成測(cè)量其直徑并計(jì)算面積(mm2)。同樣，在將標(biāo)準(zhǔn)平板于85℃加熱30 min制作成的“加熱平板”上重復(fù)上述試驗(yàn)。用生理鹽水作陰性對(duì)照，尿激酶作陽性對(duì)照。纖維蛋白降解產(chǎn)物同樣經(jīng)過SDS-PAGE分析。取牛纖維蛋白原(50 μl，0.8 g·L－1)和 5 μl凝血酶(100 kU·L－1)混合并于 37℃下溫育30 min。形成的蛋白凝塊用Tris-HCl緩沖液0.75 ml洗滌 3次，加入 2 kg·L－1的 FⅨcaⅠ0.15 ml繼續(xù)37 ℃溫育，分別在 1，5，15、30 min、1、2、8、24 h時(shí)取樣加入SDS-PAGE電泳樣品處理液作SDS-PAGE。用同樣方法以50 U·L－1的人纖溶酶0.15 ml作陽性對(duì)照。

1.3.5 FⅨcaⅠ的出血活性 昆明系小鼠(20 ±1)g，隨機(jī)分成5組，每組6只，用生理鹽水將FⅨcaⅠ配制成一系列濃度，(0.25、0.5、0.75、1、1.25 g·L－1)0.1 ml注射于小鼠背部皮下，注射6 h后，處死小白鼠，剝下皮膚，測(cè)量注射皮下出血斑的面積對(duì)樣品劑量作圖，從圖中求出最小出血?jiǎng)┝浚钚〕鲅獎(jiǎng)┝?minimum hemolytic dose，MHD)定義為引起10 mm直徑的出血斑大小所需樣品的劑量［10］。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 五步蛇組分FⅨcaⅠ的分離純化 五步蛇粗毒經(jīng)DEAE-Sephadex A-50陰離子交換層析得到10個(gè)蛋白峰(Fig 1A)，其中第二峰(FⅡ)和第9峰(FⅨ)具有較強(qiáng)的纖維蛋白溶解活性;第9峰蛋白進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析得到3個(gè)蛋白峰(Fig 1B)，其中第3峰具有纖溶活性;將第3峰蛋白再經(jīng)過Chelating Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析得到簡(jiǎn)單洗脫1個(gè)峰，梯度洗脫2個(gè)峰(Fig 1C)，其中梯度洗脫第2峰具有纖溶活性，該峰再經(jīng)過Sephadex G-50凝膠過濾層析得到的第一個(gè)峰即為目的組分FⅨcaⅠ(Fig 1D)。

2.2 FⅨcaⅠ的純度鑒定、分子量和等電點(diǎn)測(cè)定FⅨcaⅠ經(jīng)SDS-PAGE顯示為單一條帶，提示FⅨcaⅠ為單鏈蛋白(Fig 2A)。等電聚焦電泳測(cè)定FⅨcaⅠ等點(diǎn)電為4.8(Fig 2B)。質(zhì)譜MALDI-TDF-MS測(cè)得FⅨcaⅠ的分子量為23 ku。

2.3 FⅨcaⅠ蛋白溶解活性的測(cè)定

2.3.1 FⅨcaⅠ的纖維蛋白原溶解活性 SDS-PAGE結(jié)果顯示，F(xiàn)ⅨcaⅠ對(duì)牛纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈均有水解作用，但對(duì)Aα鏈最敏感，15 min內(nèi)降解完全，Bβ鏈其次，對(duì)γ鏈不敏感，約24 h后γ鏈亦出現(xiàn)一定程度的降解(Fig 3A)。人纖溶酶可迅速降解牛纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和 γ鏈(Fig 3B)。

2.3.2 FⅨcaⅠ的纖維蛋白溶解活性 采用纖維蛋白平板法測(cè)定 FⅨcaⅠ的纖溶活性。不同濃度(0.0625，0.125，0.25，0.5 g·L－1)的 FⅨcaⅠ 20 μl加到纖維蛋白平板表面。結(jié)果顯示隨著FⅨcaⅠ濃度的增加，其產(chǎn)生的透明溶解圈的面積逐漸增大(Fig 4A)。以透明溶解圈垂直兩直徑的乘積(R*R)表示纖溶活力的大小(Tab 1)，F(xiàn)ⅨcaⅠ可溶解纖維蛋白，其作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。

在普通纖維蛋白平板上，F(xiàn)ⅨcaⅠ(0.5 g·L－1)和尿激酶(20 kU·L－1)都能產(chǎn)生明顯的纖維蛋白溶解透明圈(Fig 4a);而在加熱平板上，F(xiàn)ⅨcaⅠ(0.5 g·L－1)出現(xiàn)纖維蛋白溶解圈，而尿激酶(20 kU·L－1)卻沒有纖溶現(xiàn)象(Fig 4b)，說明 FⅨcaⅠ的纖溶機(jī)制與尿激酶不同，提示FⅨcaⅠ是以直接溶解纖維蛋白為主要作用方式。

Fig 1 The purification of FⅨcaⅠ

Fig 2 Electrophoresis of FⅨcaⅠ

A:Fibrinogenolytic activity of FⅨcaⅠ;Lane 1:mixture of molecular weight standards;Lane 2:bovine fibrinogen;Lane 3～10:bovine fibrinogen incubated with FⅨcaⅠ in different time intervals:1，5，15，30 min，1，2，8，24 h;B:Fibrinogenolytic activity of plasmin;Lane 1:bovine fibrinogen;Lane 2～9:bovine fibrinogen incubated with plasmin in different time intervals:1，5，15，30 min，1，2，8，24 h;Lane 10:mixture of molecular weight standards

SDS-PAGE結(jié)果顯示，F(xiàn)ⅨcaⅠ可降解纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，8 h后才出現(xiàn)α鏈和γγ二聚體的少量降解，24 h后降解明顯，人纖溶酶可迅速降解牛纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，且人纖溶酶與FⅨcaⅠ降解纖維蛋白原產(chǎn)生的降解產(chǎn)物也不相同(Fig 5 A，B)。

Tab 1 Fibrinolytic activity of FⅨcaⅠ(n=3)

Fig 4 Fibrinolytic activity of FⅨcaⅠ

Fig 5 SDS-PAGE analysis of bovine fibrin cleavage by FⅨcaⅠand plasmin

2.4 FⅨcaⅠ的出血活性 不同濃度FⅨcaⅠ(0.25、0.5、0.75、1、1.25 g·L－1)0.1 ml注射于小鼠背部皮下，6 h后處死小鼠測(cè)量出血點(diǎn)直徑分別為(5.12 ± 0.23)、(8.57 ± 0.42)、(14.48 ±0.66)、(16.34 ± 0.58)、(22.93 ± 0.37)mm。計(jì)算最小出血?jiǎng)┝?MHD)為54.9 μg。

3 討論

血栓栓塞性疾病是目前臨床上發(fā)病率及病死率均很高的一類疾病。蛇毒纖溶酶在治療血栓栓塞性疾病方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［11］。首先，這類酶不像t-PA等受到血漿絲氨酸蛋白酶(serine proteinase inhibitors，SERINs)的抑制，能保證其長(zhǎng)效的發(fā)揮作用;其次，蛇毒纖溶酶除降解纖維蛋白原和纖維蛋白外，不水解其它凝血因子和血小板膜，因而蛇毒纖溶酶的底物特異性比血纖溶酶更專一，從安全角度出發(fā)，具有良好的開發(fā)價(jià)值;再次，對(duì)蛇毒纖溶酶蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛇毒纖溶酶與神經(jīng)生長(zhǎng)因子的N末端序列高度同源，達(dá)到80% ～90%，因此蛇毒纖溶酶具有神經(jīng)生長(zhǎng)因子作用，對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)作用，這與rtPA的作用恰好相反。

本研究中，五步蛇(安徽產(chǎn))粗毒經(jīng)四步分離純化得到具有明顯纖溶活性組分FⅨcaⅠ，分子量為23 ku，等電點(diǎn)為4.8，為單鏈蛋白，進(jìn)一步對(duì)其生物活性測(cè)定，F(xiàn)ⅨcaⅠ既可以溶解纖維蛋白原又可以溶解纖維蛋白，且其溶解作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。結(jié)果顯示:FⅨcaⅠ可降解纖維蛋白(原)的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，對(duì) Aα鏈最敏感，F(xiàn)ⅨcaⅠ優(yōu)先裂解纖維蛋白原的Aα鏈，然后緩慢裂解Bβ鏈，這同大多數(shù)具有纖溶活性的蛇毒金屬蛋白酶的選擇性作用相同。溫育較長(zhǎng)時(shí)間(濃度為0.5 g·L－1的FⅨcaⅠ與纖維蛋白原共育約24 h)后，γ鏈開始降解，且產(chǎn)物也不同于人纖溶酶，提示二者的水解方式不同。蛇毒纖溶酶與血纖溶酶的分子結(jié)構(gòu)完全不同，它們對(duì)纖維蛋白原的裂解機(jī)制及裂解位點(diǎn)也不同，對(duì)于一般的金屬蛋白酶性質(zhì)的蛇毒纖溶酶而言，作用機(jī)制是因?yàn)樗肿釉阡\離子作用下發(fā)生極化，質(zhì)子轉(zhuǎn)移至144位的谷氨酸殘基，隨后OH－對(duì)底物的賴氨酸殘基中的H原子發(fā)動(dòng)攻擊，造成413Lys-414Leu鍵斷裂，繼而發(fā)生降纖作用［12］，但實(shí)際上各種蛇毒纖溶酶的作用位點(diǎn)并不完全相同。

通過采用纖維蛋白平板法測(cè)定FⅨcaⅠ的纖溶活性，并經(jīng)過普通平板與加熱平板的對(duì)比測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ⅨcaⅠ與尿激酶的溶纖機(jī)制不同，尿激酶是通過激活纖溶酶原間接溶栓，而FⅨcaⅠ是直接起效。這是由于纖維蛋白原與纖溶酶原以結(jié)合狀態(tài)存在，所以在纖維蛋白原制劑中一般都混雜有少量的纖溶酶原。在凝血酶作用下，纖維蛋白板凝結(jié)，點(diǎn)入尿激酶后，殘留在纖維蛋白原中的纖溶酶原激活成纖溶酶進(jìn)而溶解纖維蛋白。在加熱平板上，纖溶酶因?yàn)榧訜崾Щ?，故尿激酶在加熱平板上無作用;而FⅨcaⅠ在加熱平板上仍保持著溶解纖維蛋白的能力。經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ⅨcaⅠ的纖溶作用是通過直接降解纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，但作用較慢。同時(shí)FⅨcaⅠ不具有類凝血酶或促凝因子活性，這與目前尚未有兼有纖溶和促凝雙重活性的蛇毒纖溶酶報(bào)道一致，因此其作用方式是單一的，不具有雙向作用。

我們還檢測(cè)了FⅨcaⅠ的酶學(xué)特征，證實(shí)FⅨcaⅠ為金屬蛋白酶，EDTA和DTT可明顯抑制其活性，PMSF可輕度抑制其活性，而抑肽酶對(duì)其活性無影響。Ba2+、Ca2+、Mg2+可增強(qiáng) FⅨcaⅠ的酶活性，而Zn2+、Ni2+、Cu2+可抑制其活性。酶的適宜pH為7～10，適宜溫度為30～50℃，其適宜pH偏堿性，都與人的體液外環(huán)境相符合，提示其具有較好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究從五步蛇(安徽產(chǎn))毒分離純化的FⅨcaⅠ是一種新的纖溶活性強(qiáng)，無出血活性的蛇毒纖溶酶，為開發(fā)新的溶栓藥物和研究蛇毒纖溶酶三維結(jié)構(gòu)與出血活性關(guān)系提供基礎(chǔ)。

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