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知母皂苷元對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元樹突發(fā)育的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

2011-07-28 09:57王金寧隋海娟張永興
中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) 2011年11期
關(guān)鍵詞:樹突信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分支

王金寧,董 燕,隋海娟,張永興

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,遼寧錦州 121001;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部,江蘇蘇州 215000;3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,福建廈門 361005)

神經(jīng)元樹突是神經(jīng)元接收、加工和整合輸入信息的基本部位,樹突的功能主要取決于樹突樹的分支類型和樹突分化成的樹突棘。近年研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突形成過程受多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)因素的調(diào)控[1-2]。在多種神經(jīng)退行性疾病中都伴有樹突樹和樹突棘損傷導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路的功能障礙,如海馬和皮層神經(jīng)突觸的丟失和神經(jīng)突起的功能障礙被認(rèn)為是阿爾采末病(AD)病人記憶力下降的主要原因[3]。因此,提高腦損傷病人的腦功能的關(guān)鍵是重構(gòu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),如促進(jìn)神經(jīng)突起再生和突觸形成。因此,尋找基于重建損傷腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是抗癡呆藥物研究的熱點(diǎn)之一。

越來越多的證據(jù)表明磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與樹突的形成和控制神經(jīng)元胞體生長(zhǎng)[4-5]。PI3K/Akt通過或與mTOR協(xié)同調(diào)節(jié)著突觸可塑性和記憶形成[6]。

知母皂苷元(Sarsasapogenin,SAR)為中藥知母的主要活性成分,已有研究表明知母皂苷具有提高多種擬癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能[7]和對(duì)抗淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein,Aβ)引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[8]。但關(guān)于SAR對(duì)神經(jīng)元樹突發(fā)育是否有促進(jìn)作用,目前尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)神經(jīng)元觀察SAR對(duì)正常樹突發(fā)育是否有促進(jìn)作用,并探討其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 SAR,黃色粉末,純度>98%,購(gòu)于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,臨用時(shí)用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解。DMEM、F12培養(yǎng)基購(gòu)于 Invitrogen公司;DMSO、胰蛋白(Trypsin,1 ∶250)、L-多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)均購(gòu)于Sigma公司;新生胎牛血清、馬血清購(gòu)于廣州蕊特生物科技有限公司;HEPES購(gòu)于Calbiochem公司;阿糖胞苷購(gòu)于意大利SPA公司;LY294002(#S1737)和Rapamycin(#S1842)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;mTOR Substrates Antibody Sampler Kit(#9862)、Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit(#9916)購(gòu)于 CellSignaling公司;Triciribine(#SC200661)、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)于 Beyotime試劑公司;SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。其他相關(guān)試劑均由遼寧醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取出生24 h以內(nèi)的SD大鼠乳鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),75%乙醇浸泡消毒,無菌條件下取出大腦皮層,置于培養(yǎng)基中,剔除血管和軟腦膜,剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待細(xì)胞分散后,加入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過濾,1 000×g離心10 min,用含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105~107·L-1,接種在鋪有 L-多聚賴氨酸培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg·L-1)的培養(yǎng)基,抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖。以后每3天換液1次。應(yīng)用抗特異性稀醇化酶(NSE)多克隆抗體和抗神經(jīng)絲蛋白(NF200)抗體免疫熒光染色進(jìn)行神經(jīng)元純度鑒定,結(jié)果表明神經(jīng)元純度在90%以上。

1.3 神經(jīng)元處理及樹突形態(tài)學(xué)觀察分析 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組,培養(yǎng)4 d神經(jīng)元加入0.1%的DMSO作用 48 h;SAR(10、30、100 μmol·L-1)組,培養(yǎng) 4 d神經(jīng)元加入不同劑量的SAR,作用48 h;LY組,培養(yǎng)4 d神經(jīng)元單獨(dú)加入 LY294002(30 μmol·L-1)作用48 h;SAR 30+LY組:培養(yǎng)4 d神經(jīng)元加入LY294002(30 μmol·L-1)作用 1 h,再加入 30 μmol·L-1的SAR共同作用48 h;TCBN組,培養(yǎng)4 d神經(jīng)元單獨(dú)加入 Triciribine(5 μmol·L-1)作用48 h;SAR 30+TCBN組:培養(yǎng)4 d神經(jīng)元加入Triciribine(5 μmol·L-1)作用 1 h,再加入 30 μmol·L-1的SAR共同作用48 h;Rapa組,培養(yǎng)4 d神經(jīng)元單獨(dú)加入 Rapamycin(100 nmol·L-1)作用 48 h;SAR 30+Rapa組:培養(yǎng)4 d神經(jīng)元加入Rapamycin(100 nmol·L-1)作用 1 h,再加入 30 μmol·L-1的 SAR共同作用48 h。

體外培養(yǎng)神經(jīng)元用配置CCD和Tsview軟件的Olympus CKX41型倒置相差顯微鏡,用10倍或20倍物鏡觀察以確保將一個(gè)神經(jīng)元拍攝到一個(gè)視野中,用40倍物鏡觀察樹突分支以確保能夠清楚顯示所有樹突分支。分析時(shí)采取了Ohara和Havton的命名法[9]:從胞體直接伸出的樹突分支為一級(jí)分支,從一級(jí)分支伸出的為二級(jí)分支,依次類推。用Image J軟件測(cè)量隨機(jī)選取的神經(jīng)元,測(cè)量樹突分支總長(zhǎng)度(total dendrite branch length,TDBL),神經(jīng)元一級(jí)樹突分支數(shù)目(PDN)、神經(jīng)元樹突總分支數(shù)(maximum branch order,MAO)和神經(jīng)元胞體面積。計(jì)數(shù)樣本來自3個(gè)不同批次培養(yǎng)的神經(jīng)元,每批次隨機(jī)選取10~15個(gè)細(xì)胞。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差,實(shí)驗(yàn)采取雙盲方法進(jìn)行。

1.4 Western blot法檢測(cè)磷酸化 PDK1、磷酸化Akt和磷酸化mTOR蛋白表達(dá)水平 原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,經(jīng)各種藥物處理不同時(shí)間后,用冷的PBS沖洗,立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中(1%Triton,0.1%SDS,0.5%Deoxycholate,1 mmol·L-1EDTA,20 mmol·L-1Tris(pH 7.4),150 mmol·L-1NaCl,10 mmol·L-1NaF,0.1 mmol·L-1PMSF),4℃超聲粉碎后,12 000×g離心30 min,取上清,用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品,將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用10%SDSPAGE分離蛋白質(zhì),每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μg。為了準(zhǔn)確判斷目的蛋白帶的位置,一個(gè)泳道加See Blue Plus 2預(yù)染蛋白標(biāo)記物,電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中,封閉60 min,再用TBS〔10 mmol·L-1Tris(pH 8.0),150 mmol·L-1NaCl〕洗膜3次,每次10 min。將膜放入一抗中(抗體1∶1 000稀釋),4℃過夜。TTBS沖洗后,將膜放入二抗(二抗均1∶1 000稀釋)中,室溫孵育1~2 h,用TTBS洗膜3次,每次10 min,將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min,吸干多余試劑,放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進(jìn)行Ecl化學(xué)發(fā)光。測(cè)定p-PDK1、p-Akt(Ser473)和p-mTOR的蛋白表達(dá)的改變。然后應(yīng)用蛋白漂洗液洗掉相應(yīng)的蛋白,再應(yīng)用總 PDK1、Akt、mTOR 抗體進(jìn)行 PDK1、Akt、mTOR蛋白表達(dá)測(cè)定。同樣應(yīng)用蛋白漂洗液洗掉相應(yīng)的蛋白,再應(yīng)用β-肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行β-肌動(dòng)蛋白測(cè)定,以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對(duì)蛋白帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SAR促進(jìn)皮層神經(jīng)元樹突發(fā)育作用 SAR(10、30、100 μmol·L-1)加入培養(yǎng) 4 d 神經(jīng)元作用48 h后,可明顯促進(jìn)神經(jīng)元樹突發(fā)育,表現(xiàn)為神經(jīng)元樹突總長(zhǎng)度明顯增加、一級(jí)樹突數(shù)目明顯增多、最大分支級(jí)數(shù)明顯增多及胞體面積增大,并呈明顯濃度依賴性(Tab 1,F(xiàn)ig 1)。應(yīng)用 PI3K阻斷劑LY294002(30 μmol·L-1)、Akt阻斷劑 Triciribine(5 μmol·L-1)及 mTOR 阻斷劑 Rapamycin(100 nmol·L-1)加入培養(yǎng)4 d神經(jīng)元作用1 h后,再加入SAR(30 μmol·L-1)共同作用 48 h,相差顯微鏡觀察神經(jīng)元樹突發(fā)育結(jié)果顯示:SAR 30+LY組、SAR 30+TCBN組、SAR 30+Rapamycin組的神經(jīng)元樹突總長(zhǎng)度、一級(jí)樹突數(shù)目、最大分支級(jí)數(shù)及胞體面積較SAR 30 μmol·L-1組 明顯 降低;單 獨(dú)應(yīng) 用LY294002、Rapamycin組的神經(jīng)元樹突總長(zhǎng)度、一級(jí)樹突數(shù)目、最大分支級(jí)數(shù)及胞體面積較正常對(duì)照組沒有明顯的變化,但單獨(dú)應(yīng)用Triciribine可以使神經(jīng)元的胞體變小(Tab 1,F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effect of SAR on dendritic development in cortical neurons(×400)

2.2 SAR對(duì)皮層神經(jīng)元磷酸化PDK1蛋白表達(dá)水平的影響 Fig 2 結(jié)果顯示,SAR(30、100 μmol·L-1)組可明顯增加神經(jīng)元p-PDK1的蛋白表達(dá)水平。SAR 30+LY組明顯降低神經(jīng)元p-PDK1的蛋白表達(dá)水平。單獨(dú)應(yīng)用LY294002組使神經(jīng)元p-PDK1的蛋白表達(dá)水平有所降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 2)。

Fig 2p-PDK1 protein expression increased by SAR(±s,n=3)

2.3 SAR對(duì)皮層神經(jīng)元磷酸化Akt473蛋白表達(dá)水平的影響 Fig 3結(jié)果顯示,SAR可明顯增加神經(jīng)元p-Akt473的蛋白表達(dá)水平。SAR 30+LY組及SAR 30+TCBN組明顯降低神經(jīng)元p-Akt473的蛋白表達(dá)水平。單獨(dú)應(yīng)用 LY294002組對(duì)神經(jīng)元 p-Akt473的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響,而單獨(dú)應(yīng)用TCBN組完全抑制神經(jīng)元p-Akt473的蛋白表達(dá)水平(Fig 3)。

2.4 SAR對(duì)皮層神經(jīng)元磷酸化mTOR蛋白表達(dá)水平的影響 Fig 4結(jié)果顯示,SAR可明顯增加神經(jīng)元p-mTOR的蛋白表達(dá)水平。SAR 30+LY組,SAR 30+TCBN組及SAR 30+Rapa組明顯降低神經(jīng)元 p-mTOR的蛋白表達(dá)水平。單獨(dú)應(yīng)用LY294002組及TCBN組對(duì)神經(jīng)元p-mTOR的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響,而單獨(dú)應(yīng)用Rapa組完全抑制神經(jīng)元p-mTOR的蛋白表達(dá)水平(Fig 4)。

3 討論

神經(jīng)元具有形態(tài)復(fù)雜的樹突結(jié)構(gòu),一個(gè)神經(jīng)元有一個(gè)或多個(gè)樹突,呈光滑的錐體狀從胞體發(fā)出,樹突干一般呈銳角反復(fù)分支,越分越細(xì),多數(shù)樹突干附有樹突棘。樹突的功能是接收整合臨近神經(jīng)細(xì)胞的傳入信息,樹突分支結(jié)構(gòu)和生物物理特性決定了突觸輸入輸出的過程,分支的長(zhǎng)度、數(shù)目、直徑等可反映細(xì)胞的功能狀態(tài),而許多營(yíng)養(yǎng)因子和應(yīng)激可影響樹突發(fā)育,進(jìn)而影響神經(jīng)環(huán)路的形成和功能。已有研究表明,在多種神經(jīng)退行性疾病中都伴有樹突樹和樹突棘損傷導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路的功能障礙,如AD病人記憶力下降的主要原因被認(rèn)為是海馬和皮層神經(jīng)突觸丟失及神經(jīng)突起功能障礙。

Tab 1 Dendritic development in cortical neurons increased by SAR(±s,n=30)

Tab 1 Dendritic development in cortical neurons increased by SAR(±s,n=30)

*P <0.05,**P <0.01 vs control;#P <0.05,##P <0.01 vs SAR 30 μmol·L-1

Group Dose/μmol·L -1 TDBL/μm PDN MBO Soma area/μm2 Control 258 ±22 3.36 ±0.92 2.12 ±0.45 51.6 ±5.5 SAR 10 369 ±25** 4.67 ±0.90** 2.28 ±0.81* 63.3 ±4.9**30 420 ±23** 5.18 ±0.93** 2.78 ±0.45** 89.9 ±16.2**100 503 ±58** 5.89 ±0.13** 3.16 ±0.52** 100.3 ±8.5**LY 30 267 ±26 2.94 ±0.21 2.15 ±0.34 45.3 ±7.7 SAR 30+LY 362 ±38# 4.13 ±0.2## 2.42 ±0.24# 39.9 ±13.4##TCBN 5 262 ±27 3.48 ±0.24 2.09 ±0.54 41.5 ±5.1 SAR 30+TCBN 302 ±23## 3.42 ±0.25## 2.34 ±0.19## 36.8 ±8.3##Rapa 0.1 273 ±24 3.54 ±0.7 2.11 ±0.29 49.6 ±5.7 SAR 30+Rapa 327 ±25## 3.28 ±0.19## 2.46 ±0.36# 57.9 ±7.2#

Fig 3p-Akt protein expression increased by SAR(±s,n=3)

Fig 4p-mTOR protein expression increased by SAR(±s,n=3)

PI3K/Akt通過或與mTOR協(xié)同調(diào)節(jié)著突觸可塑性和記憶形成。PI3K[10]是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體,靜息狀態(tài)下普遍存在于胞質(zhì)中,當(dāng)接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)后被激活,聚集到細(xì)胞膜上把底物Ptd Ins(4,5)P2(PIP2)轉(zhuǎn)化為 Ptd Ins(3,4,5)P3(PIP3)。PIP3作為第二信使,激活下游的Akt蛋白等。Akt蛋白為細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄病毒v-Akt的同源物所編碼一種蛋白激酶,在靜息細(xì)胞中大部分位于胞質(zhì)中。由于與PKA和PKC有相似性,所以又被稱為蛋白激酶B(PKB)。活化后的PI3K在膜上生成PIP3,PIP3通過與Akt蛋白的PH結(jié)構(gòu)域的相互作用,聚集Akt蛋白到膜上,在3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)的幫助下,通過使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser473)磷酸化而使其激活。激活后的Akt蛋白再轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)中或胞核內(nèi),通過對(duì)一系列底物的磷酸化,使其下游的mTOR激活,它們共同調(diào)節(jié)突觸的形成與連接。

隨著國(guó)際老齡化,老年性癡呆患者逐漸增多,世界醫(yī)學(xué)界越來越重視采用天然藥物防治老年性癡呆。SAR是從中草藥知母中提取分離的有效成分,對(duì)老年性癡呆有一定治療作用,能改善患者學(xué)習(xí)記憶能力。我們實(shí)驗(yàn)室研究已表明SAR可通過抑制Akt/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮抑制炎癥因子的釋放而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[11]。本研究表明,SAR可明顯促進(jìn)神經(jīng)元樹突發(fā)育,表現(xiàn)為神經(jīng)元樹突總長(zhǎng)度明顯增加、一級(jí)樹突數(shù)目明顯增多、最大分支級(jí)數(shù)明顯增多及胞體面積增大,并呈明顯濃度依賴性。而應(yīng)用各阻斷劑后,SAR 30+各阻斷劑組的神經(jīng)元樹突總長(zhǎng)度、一級(jí)樹突數(shù)目、最大分支級(jí)數(shù)及胞體面積明顯降低,結(jié)果表明SAR促進(jìn)樹突發(fā)育的作用可能與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。通過測(cè)定p-PDK1、p-Akt473及p-mTOR的蛋白表達(dá)變化進(jìn)一步說明SAR對(duì)樹突發(fā)育的促進(jìn)作用與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。我們將更深入的探討研究,為AD病人的治療提供更廣闊的思路。

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