邱龍新 林一平 林臻楨 林麗欽 戴愛玲 楊小燕 (龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,龍巖364000)

植物異黃酮是一類與人類生活息息相關(guān)的植物雌激素,長期以來其雌激素樣作用、抗腫瘤作用、心血管保護(hù)作用和抗氧化作用受到廣泛重視和深入研究。最近,植物異黃酮在抗炎癥方面的作用引起了越來越多的關(guān)注[1]。紅車軸草異黃酮提取物能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子,說明該異黃酮提取物具有抗炎癥的作用[2]。大豆異黃酮、鷹嘴豆異黃酮提取物等植物異黃酮也都具有類似的抗炎作用。大豆異黃酮主要含有染料木黃酮、大豆素等異黃酮成分,而紅車軸草異黃酮主要含有鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黃酮、大豆素等4種異黃酮成分。目前,大豆異黃酮的抗炎作用被認(rèn)為主要是染料木黃酮的作用。染料木黃酮的抗炎作用和機制已經(jīng)得到較為深入的研究[1],但是,對于鷹嘴豆芽素A的抗炎作用卻少有報道,對于其機制的研究更是尚未見報道。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員之一,目前已知有三種亞型:PPARα、β/δ和γ。PPARs在免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá),近年來的研究發(fā)現(xiàn),PPARs在抵抗炎性疾病和免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用[3]。有趣的是,鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黃酮等具有PPARα/γ雙激動劑活性,一些研究據(jù)此推測這些異黃酮的抗炎作用與其PPARα/γ雙激動劑活性有關(guān)[2,4]。但是,目前并沒有直接的證據(jù)證明鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素、染料木黃酮等通過PPARα/γ途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)。另外,在單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中PPARα與PPARγ均有較多表達(dá)而在巨噬細(xì)胞中PPARα幾乎不表達(dá)[5,6]。為了研究鷹嘴豆芽素A對免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的影響及其與PPARα/γ的關(guān)系,以外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)為研究材料將較為合適。綜上,本研究將因此利用PBMCs探討鷹嘴豆芽素A的抗炎作用及其是否通過PPARα/γ途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 豬血采自福建龍巖龍馬種豬場;Ficollpague淋巴細(xì)胞分離液購自GE Healthcare公司;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Trizol購自Invitrogen公司;LPS、鷹嘴豆芽素 A、GW9662、MK886、羊抗兔 IgG-HRP 等購自 Sigma公司;NF-κB p65抗體購自 Cell Signaling公司;PCRmix購自廣州東盛生物科技有限公司;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;其它試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 豬PBMCs的分離與藥物處理 采集豬血自150日齡杜×長×大母豬,利用Ficoll-paque淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077 g/ml)按廠家說明分離豬PBMCs。細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)并以1×107個/ml的密度將細(xì)胞接入24孔板,在 5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)。加入待研究藥物孵育3小時,然后加入LPS(終濃度1μg/ml)進(jìn)行刺激。

1.2.2 PBMCs分泌 TNF-α、IL-6的測定 LPS處理細(xì)胞6小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,2 000 r/min離心15分鐘后收集上清液,利用ELISA試劑盒(R&D systems)按廠家說明測定上清液中TNF-α、IL-6的含量。

1.2.3 RT-PCR分析TNF-α、IL-6 mRNA 的表達(dá)LPS處理細(xì)胞6小時后,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,利用 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒(Fermentas)按廠家說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR 擴(kuò)增 TNF-α、IL-6,以 β-Actin作為內(nèi)參。引物序列如下,Sense:5′-CGTTGTAGCCAATGTCAAAGCC-3′,Antisense:5′-TGCCCAGATTCAGCAAAGTCCA-3′(TNF-α);Sense:5′-CCAGGAACCCAGCTATGAAC-3′,Antisense:5′-CTGCAGAGCCTCGACATT-3′(IL-6);Sense:5′-CTGGCATTATCATAAACTCT-3′,Antisense:5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′(β-Actin)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后用溴化乙錠顯色。

1.2.4 NF-κB活性的分析 NF-κB的激活可以通過它從胞漿移位至胞核來判定。LPS處理細(xì)胞30分鐘后,用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒按廠家說明進(jìn)行操作分別獲得胞漿與胞核蛋白。用Western blot技術(shù)檢測NF-κB的進(jìn)核情況。一抗(NF-κB p65)以1∶1 000濃度4℃孵育過夜,二抗(羊抗兔)以1∶2 000濃度孵育2小時后顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件處理。組間用One-Way ANOVA with Newman-Keuls Multiple Comparison Test比較。當(dāng)P值＜0.05時差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鷹嘴豆芽素A對LPS刺激豬PBMCs后TNF-α、IL-6分泌量和mRNA表達(dá)的影響 TNF-α是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的促炎癥細(xì)胞因子。ELISA結(jié)果顯示,豬PBMCs在經(jīng)LPS刺激后,TNF-α的分泌較未經(jīng)LPS刺激時大幅上調(diào)(P＜0.001,圖1A)。而在加入LPS刺激前3小時用鷹嘴豆芽素A預(yù)處理細(xì)胞則能顯著抑制由LPS刺激引起的TNF-α的分泌,終濃度為100μmol/L的鷹嘴豆芽素A(P＜0.001)比50 μmol/L的(P＜0.01)抑制作用效果更明顯。利用RT-PCR分析mRNA表達(dá)的結(jié)果進(jìn)一步證明了鷹嘴豆芽素A抑制TNF-α生成的作用(圖1B)。

IL-6為另一種促炎癥細(xì)胞因子。如圖2A所示,豬PBMCs在經(jīng)LPS刺激后,IL-6的分泌較未經(jīng)LPS刺激時大幅上調(diào)(P＜0.001)。同樣的,在加入LPS刺激前3小時用鷹嘴豆芽素A預(yù)處理細(xì)胞則能顯著抑制由LPS刺激引起的IL-6分泌量的增加,終濃度為100μmol/L的鷹嘴豆芽素A(P＜0.001)比50 μmol/L的(P＜0.01)抑制作用效果更明顯。對IL-6 mRNA表達(dá)的研究進(jìn)一步證實了上述鷹嘴豆芽素A抑制IL-6生成的結(jié)果(圖2B)。這些以TNF-α和 IL-6為代表的結(jié)果表明鷹嘴豆芽素A能顯著地抑制PBMCs分泌炎性細(xì)胞因子。

圖1 鷹嘴豆芽素A對LPS刺激豬PBMCs后TNF-α分泌(A)和mRNA表達(dá)(B)的影響Fig.1 Effect of biochanin A on the secretion(A)and mRNA expression(B)of TNF-αin porcine PBMCs

圖2 鷹嘴豆芽素A對LPS刺激豬 PBMCs后IL-6分泌(A)和mRNA表達(dá)(B)的影響Fig.2 Effect of biochanin A on the secretion(A)and mRNA expression(B)of IL-6 in porcine PBMCs

2.2 鷹嘴豆芽素A對LPS刺激豬PBMCs后NF-κB激活的影響 NF-κB的激活對LPS誘導(dǎo)炎癥因子的釋放具有重要作用。NF-κB在正常情況下以無活性的三聚體形式存在于胞漿中,受刺激活化進(jìn)入細(xì)胞核引起下游多種基因表達(dá),NF-κB通路是LPS誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵信號通路?？梢酝ㄟ^Western blot技術(shù)分析NF-κB蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的轉(zhuǎn)移來檢測NF-κB的激活。如圖3所示,在正常情況下豬PBMCs細(xì)胞核內(nèi)僅有少量的NF-κB,在經(jīng)30分鐘LPS處理后胞漿內(nèi)NF-κB蛋白含量下降,核內(nèi)NF-κB含量顯著增加,說明 LPS處理后NF-κB被激活。而在LPS刺激前用鷹嘴豆芽素A預(yù)處理3小時,可抑制NF-κB的進(jìn)核,說明鷹嘴豆芽素A可以抑制LPS誘導(dǎo)的豬PBMCs NF-κB信號途徑的活化。

2.3 鷹嘴豆芽素A通過PPARα與PPARγ途徑抑制LPS刺激豬PBMCs后NF-κB的激活 LPS刺激前用終濃度為100μmol/L的鷹嘴豆芽素A和10μmol/L PPARγ拮抗劑GW9662共同預(yù)處理豬PBMCs,這時PPARγ的作用會被GW9662大幅消除。圖4顯示,在PPARγ無法發(fā)揮作用的情況下,鷹嘴豆芽素A對LPS誘導(dǎo)的豬PBMCs NF-κB信號途徑活化的抑制作用被顯著減弱;同樣,LPS刺激前用鷹嘴豆芽素A和20μmol/L PPARα拮抗劑 MK886共同預(yù)處理豬PBMCs以抑制 PPARα途徑,鷹嘴豆芽素A對LPS誘導(dǎo)的豬PBMCs NF-κB信號途徑活化的抑制作用也被顯著減弱。說明鷹嘴豆芽素A可以通過PPARα和PPARγ途徑抑制 LPS誘導(dǎo)的豬PBMCs NF-κB信號途徑的活化,鷹嘴豆芽素A對LPS刺激PBMCs后炎癥因子的釋放具有抑制作用的原因至少有一部分可歸因于鷹嘴豆芽素A通過PPARα和PPARγ途徑調(diào)控NF-κB信號途徑的活化。

圖3 鷹嘴豆芽素 A對LPS刺激豬PBMCs后NF-κB p65進(jìn)核激活的影響Fig.3 Effect of biochanin A on the nuclear translocation of NF-κB p65

圖4 PPARα或 PPARγ拮抗劑減弱了鷹嘴豆芽素A對LPS誘導(dǎo)豬PBMCs NF-κB p65進(jìn)核激活的抑制作用Fig.4 PPARαor PPARγantagonist attenuated the suppression effect of biochanin A on the nuclear translocation of NF-κBp65 in LPS-stimulated porcine PBMCs

3 討論

體內(nèi)體外的一些研究已經(jīng)證明一些異黃酮具有抗炎作用。在這些異黃酮化合物中,染料木黃酮是被最為廣泛研究的一種,它的抗炎作用在小鼠、人體內(nèi)和在一些細(xì)胞株內(nèi)被深入探討[1]。大豆素的抗炎癥作用也有過一些報道[1]。然而,對鷹嘴豆芽素A的抗炎癥作用卻很少有報道。本研究報道了鷹嘴豆芽素A具有抑制豬PBMCs經(jīng)LPS刺激引起TNF-α和IL-6等炎癥因子分泌的作用,這與Muller等[2]在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的研究結(jié)果一起證實了鷹嘴豆芽素A的抗炎癥作用。

染料木黃酮的抗炎作用機制已被深入地研究,它可以通過抗氧化和清除自由基、抑制COX-2的表達(dá)、調(diào)控MAPK的表達(dá)和調(diào)控NF-κB信號途徑來抵抗炎癥反應(yīng)[7-12]。然而,鷹嘴豆芽素A的抗炎作用機制未見任何報道。本研究報道了鷹嘴豆芽素A可以通過抑制LPS誘導(dǎo)NF-κB信號途徑的活化來抑制炎癥反應(yīng),同時,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了鷹嘴豆芽素A對NF-κB信號途徑的調(diào)控是依賴于PPARα和PPARγ這兩種核受體的。有趣的是,刺芒柄花素具有比鷹嘴豆芽素A更高效的PPARα/γ激動劑活性,但是其抑制RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6的能力卻比鷹嘴豆芽素 A更低[2,4]。更為復(fù)雜的是,PPARγ激動劑匹格列酮具有抑制RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的作用而PPARγ另一種激動劑羅格列酮卻沒有這種作用[5,13]。本研究小組在RAW264.7細(xì)胞中進(jìn)行的研究也發(fā)現(xiàn)雖然染料木黃酮具有PPARα/γ激動劑活性,但其對炎癥因子釋放的抑制并不依賴于PPARα/γ途徑(數(shù)據(jù)未展示)。另外,本研究小組還發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細(xì)胞中,鷹嘴豆芽素A的抗炎作用只依賴于PPARγ途徑而不依賴于PPARα途徑(數(shù)據(jù)未展示),這可能與在RAW264.7細(xì)胞中PPARα的表達(dá)量很低有關(guān)。總之,異黃酮的抗炎癥作用與其PPARα/γ激動劑活性的關(guān)系還有待更深入的研究。

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