楊金廣，張 帥，申莉莉，錢(qián)玉梅，李 曉，王鳳龍*，段燕平，林北森，王 永，曹 娜

（1.煙草行業(yè)病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；3.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司，廣西 百色 533000；4.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，濟(jì)南 250100）

作為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的代表種，煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是一種分布廣泛的植物病毒，可侵染煙草和番茄以及其他茄科植物等300多種植物，具有廣泛的寄主范圍，為正單鏈RNA（+ssRNA）病毒。其基因組由6 395 nt組成[1]，至少編碼 4 個(gè)蛋白[2-4]，126 kDa 和183 kDa兩個(gè)蛋白編碼病毒的復(fù)制酶基因，是病毒復(fù)制所必需的，30 kDa的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein,MP）控制著病毒胞間運(yùn)動(dòng)。17 kDa的外殼蛋白（coat protein,CP）是病毒的包裝衣殼，對(duì)病毒在寄主維管束組織的長(zhǎng)距離運(yùn)輸具有重要的作用?；蚪M 5′ 端和 3′ 端非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs）具有調(diào)控RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的功能，并對(duì)RNA的穩(wěn)定也至關(guān)重要，具有RNA復(fù)制和合成起始的識(shí)別位點(diǎn)[4-7]。

TMV作為最早研究的病毒，其檢測(cè)體系已比較完善。常見(jiàn)的有電鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子檢測(cè)（RT-PCR、real-time RT-PCR、PCR-ELISA 和Western-bloting），這些方法雖然對(duì) TMV檢測(cè)具有高度的特異性和靈敏性，但均需要專(zhuān)門(mén)昂貴的設(shè)備儀器和試劑，并且耗時(shí)較長(zhǎng)，例如血清學(xué)檢測(cè)一般需要12 h以上，而RT-PCR也需要6 h左右。本研究對(duì)感染TMV的煙草葉片的水提物進(jìn)行了檢測(cè)，能夠穩(wěn)定的檢測(cè)到與TMV相關(guān)的特異性條帶，為檢測(cè)煙草中的TMV侵染提供了更快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2008年采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島市即墨試驗(yàn)基地呈典型煙草花葉病癥狀的煙草葉片，經(jīng)枯三生煙草單斑分離后，保存在云煙 85植株上，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)確定為T(mén)MV，防蟲(chóng)條件下，置于溫室中，在14 h光照和10 h黑暗的光周期下進(jìn)行保存培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 煙草葉片水提物提取與檢測(cè) 取0.1 g新鮮的煙草葉片，置于100 μL無(wú)菌水中，研磨成勻漿，12 000 rpm，離心5 min，取上清液20 μL于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集圖像。

1.2.2 總RNA提取 取煙草TMV病葉0.05 g，于液氮中研磨成粉末狀，加入1 mL TRIzol reagent充分研磨，室溫放置5 min；加入氯仿200 μL，充分震蕩15 s，室溫放置5 min；12 000 rpm，4 ℃下離心 15 min；將上層水相轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入0.5 mL異丙醇；12 000 rpm，4 ℃離心10 min（可見(jiàn)RNA沉淀），棄去上清；加入1 mL 70%乙醇（渦漩，7 000 rpm離心5 min）；干燥RNA沉淀，加ddH2O 20 μL溶解即可。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 取提取后的總RNA 3 μL，利用M-MLVEasyscriptReverse Transcriptase試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行cDNA合成，具體方法均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取 1 μL cDNA產(chǎn)物，利用用于PCR檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)體系由10 μL 5×PCR buffer，2 μL dNTP mixture (2.5 mM)，正反向引物各 2 μL（10 μM）（CPF：5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAGCAC-3′；CPR：5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′）和 10 μL ddH2O組成，反應(yīng)在50 μL的體積中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：第一步95 ℃，4 min；第二步95 ℃，15 s，62 ℃，35 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，取 8 μL反應(yīng)液在 1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集圖像。

1.2.4 Northern-blotting分析 以TMV復(fù)制酶基因(accession number:AF395127; TMV-F:5′-GTTTCAGGATTCCCGTAC-3′; TMV-R:5′-ATCAGAAATATCGCCAGT-3′;)為靶基因，利用地高辛標(biāo)記的 dUTP (DIG DNA Labeling and Detection Kit,Roche Applied Science)通過(guò) RT-PCR合成一段600 bp的DNA探針。新鮮提取的TMV病葉水提物40 μL上樣于10%甲醛變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上；然后65 ℃條件下，與探針?lè)磻?yīng)16 h；2 × SSC和0.1%SDS于50 ℃條件下，洗滌2次，每次15 min；0.5× SSC和0.1% SDS于65 ℃條件下，洗滌2次，每次20 min；最后根據(jù)顯色試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行顯色反應(yīng)（Roche Biochemicals）。

2 結(jié) 果

提取后的水提物經(jīng)過(guò) 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TMV陽(yáng)性植株中能夠穩(wěn)定地檢測(cè)到6 000 bp左右的條帶，而在健康煙草葉片水提物中檢測(cè)不到任何電泳條帶（圖1）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性與特異性，利用TMV特異性引物，對(duì)相同材料進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果表明，在TMV陽(yáng)性植株中能夠檢測(cè)到83 bp的片段，大小與預(yù)期相符（結(jié)果未顯示），而在健康煙草中，檢測(cè)不到任何條帶，說(shuō)明該方法具有較高的特異性。為了進(jìn)一步揭示水提物中的特異性電泳條帶，以TMV 復(fù)制酶基因?yàn)樘结?，通過(guò)Northern-blotting分析，結(jié)果顯示，水提物中電泳條帶與探針具有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，而在健康煙株、PVY病株和CMV病株3種水提物中均檢測(cè)不到任何雜交信號(hào)（圖2），暗示該電泳條帶可能為T(mén)MV的基因組RNA。值得注意的是在該檢測(cè)體系中，水提物在常溫下非常不穩(wěn)定，需要提取完畢后，立刻進(jìn)行電泳檢測(cè)，在室溫條件下靜置 2 h，檢測(cè)的電泳條帶就變得非常微弱（圖1），而靜置3 h以上，就很難再檢測(cè)到任何電泳條帶（圖1）。

圖1 TMV煙草葉片水提物檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The aqueous extract detection of tobacco leaves infected by TMV

圖2 不同煙草材料水提物的Northern-blotting分析Fig.2 Northern blot analysis of aqueous extract from TMV tobacco plant

3 討 論

在TMV煙草病葉中能夠檢測(cè)的6 000 bp左右的電泳條帶，推測(cè)該條帶可能為T(mén)MV基因組產(chǎn)物，因?yàn)門(mén)MV基因組大小為6 395 nt組成。同時(shí)，室溫條件下，水提物的不穩(wěn)定性也暗示該條帶可能為RNA，因?yàn)?TMV為+ssRNA，RNA在沒(méi)有經(jīng)過(guò)DEPC處理的環(huán)境中，及RNase存在的條件下，極易被RNase降解，而TMV也是+ssRNA病毒。因此，綜合兩方面推測(cè)在TMV病葉水提物中檢測(cè)到6 000 bp的電泳條帶可能為T(mén)MV基因組RNA。

李凡等曾利用水作為提取液來(lái)檢測(cè)煙草叢頂病毒，能夠檢測(cè)到與病害特異性 900 bp小分子RNA，但是單純的水提物穩(wěn)定性差，重復(fù)性不好，為此研究者對(duì)方法進(jìn)行了修改，對(duì)水提物重新進(jìn)行了異丙醇或NaAC進(jìn)行沉淀，然后利用75%的乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果非常穩(wěn)定和特異。但在本研究中，利用李凡等的異丙醇和NaAC沉淀法，檢測(cè)結(jié)果并不理想，推測(cè)李凡等檢測(cè)的900 bp的小分子RNA可能為雙鏈RNA（dsRNA）[8]。而在本研究中檢測(cè)到 6 000 bp左右的條帶可能為+ssRNA，dsRNA較+ssRNA在常溫下更穩(wěn)定。

同時(shí)該檢測(cè)方法還具有方便快速的特點(diǎn)，在常規(guī)檢測(cè)中耗時(shí)均較長(zhǎng)，例如生物學(xué)檢測(cè)需要5～10 d才能檢測(cè)出來(lái)，并且易受周?chē)h(huán)境和寄主的影響，ELISA需要12 h左右，RT-PCR則需要3 h以上。而該方法只需15 min即可檢測(cè)到TMV的存在。同時(shí)較ELISA和RT-PCR更加經(jīng)濟(jì)，不需要昂貴的儀器，僅需要一個(gè)電泳槽和紫外觀(guān)察裝置。

作為一種快速檢測(cè)的方法，也具有一定的局限性，就是在檢測(cè)過(guò)程中需要電泳裝置，這在實(shí)際生產(chǎn)中是很難進(jìn)行推廣應(yīng)用的。因此，生產(chǎn)中非常需要研究和開(kāi)發(fā)更加方便快捷的檢測(cè)方法與工具，當(dāng)前，在其他研究材料中常用的試紙條快速檢測(cè)是值得推薦的一種方法。

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