朱竹先 張子強(qiáng) 苗 華 許冬梅 (山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟(jì)南 25004)

高血壓導(dǎo)致最直接的損害是靶器官結(jié)構(gòu)功能的損害，是引起各種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在高血壓形成、發(fā)展及靶器官重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)阻斷RAAS的受體環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)應(yīng)用ARB評(píng)價(jià)其對(duì)老年高血壓大鼠RAAS系統(tǒng)及腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)、c-fos表達(dá)的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 40周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)20只(上海第二醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，清潔級(jí)，體重200～250 g，雌雄各半。正常飼養(yǎng)。隨機(jī)分組(n=10):SHR-C(空白對(duì)照組)、SHR-B+L(貝那普利+纈沙坦組)以及老齡Wistar京都大鼠(WKY)對(duì)照組。SHR-L 組:纈沙坦 15 mg·kg－1·d－1;SHR-C組和老齡WKY大鼠組均同樣給予等量生理鹽水。各組大鼠經(jīng)胃管給藥，干預(yù)12 w。

1.2 藥品及試劑 纈沙坦，杭州默沙東制藥有限公司提供。膠原Ⅳ一抗，即用型SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。MMP-9、c-fos引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本留置 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，取腎臟組織，－70℃保存待檢測(cè)。

1.3.2 免疫組化 應(yīng)用SABC試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片觀察。

1.3.3 大鼠腎臟MMP-9、c-fos mRNA檢測(cè) ?。?0℃保存的大鼠腎臟組織，采用Trizol(Invitrogen，USA)勻漿，氯仿-異丙醇法抽提總RNA。

1.3.4 RT-PCR 取總 RNA 1 μg，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)(TAKARA)，RT產(chǎn)物-20℃保存。PCR引物:β-actin，上游:5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGGC-3'，下 游:5'-cagcactgtgttggcatagagg-3'。MMP-9引物:上游:5'-TTTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'，下游:5'-AGGGCGAGGACCATAGAGG-3'。c-fos引物:上游:5'-ACCAGTCCGGACCTGCAGTGG-3'，下游:5'-GCGGCATTTGGCTGCAGCCAT-3'。以上引物均為上海生工合成。cDNA的合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用SYBR Ex Script RT-PCR Kit(TAKARA)，同時(shí)設(shè)不加模板cDNA的陰性對(duì)照。應(yīng)用Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循環(huán)40次。擴(kuò)增完成后從60℃開(kāi)始升溫作熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3.5 Western印跡雜交 取腎臟組織中加入濕重組織體積的3～5倍體積的組織裂解液提取總蛋白，取10 μg蛋白提取液用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度，取40 μl蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入稀釋后的一抗、二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔單克隆IgG)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。用DAB溶液檢測(cè)雜交信號(hào)，結(jié)果用Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定各條帶積分灰度值，所得結(jié)果為扣除背景的積分光密度(OD)，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，測(cè)定數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 干預(yù)12 w后，SHR對(duì)照組的大鼠死亡1只，SHR藥物治療組與SHR對(duì)照組比較，收縮壓(SBP)明顯降低，有顯著差異性，但仍高于WKY對(duì)照組;三組心率無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化結(jié)果 干預(yù)12 w后與WKY對(duì)照組大鼠腎臟膠原Ⅳ免疫組化表達(dá)(n=10，5.12±1.11)比較，SHR對(duì)照組腎臟組織膠原Ⅳ含量明顯增高(n=9，13.21±3.5，P＜0.01)，藥物干預(yù)組能顯著降低膠原Ⅳ表達(dá)(n=10，6.66±1.06，P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

表1 干預(yù)12 w后各組大鼠收縮壓、心率比較(±s)

表1 干預(yù)12 w后各組大鼠收縮壓、心率比較(±s)

與WKY對(duì)照組比較:1)P＜0.01，與SHR對(duì)照組比較:2)P＜0.01

組別 n 收縮壓(mmHg) 心率(次/min)WKY對(duì)照組10 130.00±31.33 378.37±39.00 SHR對(duì)照組 9 222.66±21.581) 391.22±29.11干預(yù)組 10 160.60±18.292)369.53±30.00

圖1 各組腎臟膠原Ⅳ免疫組化表達(dá)(DAB，×200)

圖2 各組MMP-9、c-fos mRNA表達(dá)

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果 SHR對(duì)照組MMP-9、c-fos mRNA表達(dá)明顯高于WKY對(duì)照組(P＜0.01)，藥物干預(yù)組能顯著降低MMP-9、c-fos mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

2.4 Western印跡結(jié)果 SHR組MMP-9、c-fos蛋白表達(dá)顯著高于WKY對(duì)照組(P＜0.01)，藥物干預(yù)組均能夠降低MMP-9、c-fos蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組MMP-9、c-fos蛋白表達(dá)

3 討論

腎臟對(duì)高血壓引起的血流動(dòng)力學(xué)刺激發(fā)生適應(yīng)性代償反應(yīng)，可以導(dǎo)致病理性腎臟重構(gòu)。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在高血壓器官重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用〔1〕。ARB阻斷RAAS的受體水平，理論上能夠有效阻斷AngⅡ?qū)T1受體的作用，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。此外，ARB可以有效改善單純應(yīng)用ACEI所導(dǎo)致的組織醛固酮逃逸現(xiàn)象〔2〕。本實(shí)驗(yàn)中，與WKY對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組SBP明顯下降。SHR對(duì)照組血漿AngⅡ明顯增高，藥物干預(yù)組AngⅡ明顯降低。提示ARB能夠有效抑制RAAS系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)中，與WKY對(duì)照組比較，SHR對(duì)照組及藥物干預(yù)組腎臟組織Ⅳ型膠原表達(dá)明顯增高，藥物干預(yù)組能夠降低膠原表達(dá)提示:Ⅳ型膠原增生在高血壓腎臟中發(fā)揮重要作用，而阻斷RAAS系統(tǒng)能有效降低其表達(dá)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)能夠特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)，在器官組織重構(gòu)中起重要的作用。有研究顯示，在高血壓腎臟病中的的MMP-9表達(dá)和活性增高〔3，4〕。這說(shuō)明MMP-9在腎臟重構(gòu)過(guò)程對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分解產(chǎn)生重要的影響。此外，研究同樣發(fā)現(xiàn)，c-fos在在高血壓腎臟病腎臟重構(gòu)過(guò)程也發(fā)揮重要作用〔5〕。本研究通過(guò)對(duì)老齡高血壓大鼠研究發(fā)現(xiàn)，SHR腎臟中MMP-9的表達(dá)較同齡WKY明顯增多，在SHR，RAAS過(guò)度激活，以及c-fos等生長(zhǎng)因子促進(jìn)腎臟Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，但MMP-9的過(guò)表達(dá)說(shuō)明，MMP-9增強(qiáng)部分腎臟Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，均提示MMP-9在腎臟重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，與WKY對(duì)照組比較，SHR各組c-fos明顯增高，提示AngⅡ結(jié)合AT1受體，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)一步促進(jìn)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的c-fos等因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增生和肥大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果:老齡SHR組MMP-9及c-fos mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于WKY對(duì)照組，藥物干預(yù)組能夠顯著降低其表達(dá)水平，此外，藥物干預(yù)組顯著降低腎臟Ⅳ型膠原的表達(dá)水平，說(shuō)明ARB類藥物能夠阻斷RAAS系統(tǒng)部分通過(guò)抑制MMP-9及c-fos途徑改善腎臟重構(gòu)，發(fā)揮保護(hù)性作用。

綜上，本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，應(yīng)用ARB可以有效保護(hù)靶器官，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)器官重構(gòu)。

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2 李淑梅.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體1拮抗劑對(duì)組織醛固酮逃逸現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華心血管病雜志，2001;29(5):549-52.

3 Nicoletti A，Heudes D，Hinglais N，et al.Lelf ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats〔J〕.Hypertension，1995;26(1):101-11.

4 苗 偉，高 楓，龔少愚，等.原發(fā)性高血壓患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶9與升主動(dòng)脈彈性的關(guān)系〔J〕.中華高血壓雜志，2010;4(3):385-9.

5 院紅梅，潘敬遠(yuǎn).雙腎雙夾腎性高血壓大鼠左心室原癌基因c-fos表達(dá)的變化〔J〕.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002;30(1):62-3.