黎洪展 呂永恒 陳 琪 黃光勝 (南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510315)

目前研究認為動脈粥樣硬化(AS)過程不僅僅是脂質在動脈壁中的聚積，而且是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細胞因子的過度釋放是形成的重要步驟已經被廣泛接受〔1〕。近幾年研究發(fā)現作為黏附分子家族中的重要一員血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)參與了AS的形成過程〔2〕，丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，Tsn)具有逆轉AS的作用〔3〕。本研究旨在探討Tsn對試驗性大鼠AS形成及主動脈VCAM-1表達的影響，為AS的防治及丹參類中藥的臨床應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥 健康SD雄性大鼠，30只，體質量(180±10)kg。將大鼠隨機分為3組:正常對照組、模型組和Tsn組，每組10只。大鼠適應性飼養(yǎng)后，除正常對照組外，各組按50萬IU/kg的總劑量灌胃給予維生素D3，分3 d給完，正常對照組，僅飼以普通柱狀大鼠標準飼料;其余各組進食高脂飼料:大鼠標準飼料83%，膽固醇2%，豬油10%，白砂糖5%，每天每只給予15 g高脂飼料，期間全部自由飲水。給予高脂飼料4 d后，開始灌服丹參酮ⅡA每日10 mg/kg灌服，空白組和模型組每天灌服雙蒸餾水5 ml/kg，12 w后實驗。

1.2 主要實驗試劑和儀器 丹參酮ⅡA(純度85%)購自上海第一生物化學藥業(yè)有限公司;VCAM-1單克隆抗體(1∶100)，購自武漢博士德生物工程公司。即用型SABC免疫組化試劑盒(含生物素標記山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根過氧化物酶標記鏈霉菌卵白素工作液)和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;蘇丹Ⅲ為天津市大茂化學試劑廠產品;荷蘭威圖全自動生化分析儀;LeicaRM2125切片機和LeicaDME321058943PX顯微攝像機由德國徠卡公司生產;OLYMPUS CH20BIMF200-2顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產。

1.3 方法

1.3.1 血脂測定 第12周末從眼眶取血，取血前禁食12 h，離心，取血清，在自動化生化儀上測定血清總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3.2 主動脈病變病理檢查 試驗結束后，予0.6 ml/kg速眠新后肢外側肌肉注射麻醉大鼠，于無菌條件下迅速取出主動脈，剝凈外膜和周圍脂肪，沿背側正中線縱向剪開，用0.9%生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，用15%中性甲醛固定。蘇丹Ⅲ染色，用500萬像素的數碼照相機近距離照相，采用全自動圖像分析系統(tǒng)(Penguin2600CL DX51TR美國)計算管腔面積、新生內膜面積及內膜增生百分比。HE染色，在顯微鏡下觀察主動脈的壁厚度、內膜泡沫細胞的含量、內膜炎癥、內膜脂質沉積程度的變化。

1.3.3 主動脈VCAM-1免疫組織化學染色 在胸主動脈中段定位切取2 mm×5 mm組織，制石蠟切片，PBS洗3次，每次3 min，按免疫組化試劑盒說明進行免疫組化染色，在顯微鏡高倍視野下觀察分析陽性結果，采用圖像分析系統(tǒng)，以陽性表達的百分率半定量分析VCAM-1表達的強弱。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，組間差異采用單向方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 血脂檢查結果 高脂飲食組、高脂飲食加丹參酮高、中、低劑量組TC、TG、LDL-C水平較對照組顯著升高(P＜0.01)。高脂飲食組與Tsn組血清TC、TG、LDL-C水平差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 主動脈病理學改變 肉眼可見對照組內膜光滑，無斑塊形成。高脂模型組血管表面不光滑，凹凸不平，大量黃白色斑塊突出于管腔表面，并連接成片，尤以近主動脈弓處及血管開口處最為明顯。HE染色可見模型組的內膜顯著增厚，內膜不完整，內皮下腔隙增大，內含大量泡沫細胞，中彈力纖維增粗，彈力纖維和膠原纖維排列紊亂。組主動脈內膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質沉積、散在的泡沫細胞和炎癥細胞。與對照組相比，模型組管腔面積減小、新生內膜面積增大、內膜增生百分比增大(P＜0.001)。與模型組相比，Tsn組管腔面積增大、新生內膜面積減小、內膜增生百分比減小(P＜0.05)。見表2。

2.3 主動脈VCAM-1免疫組化檢測 VCAM-1在模型組的表達為(33.67±5.43)%，較對照組的(0.55±0.25)%明顯增高(P＜0.01)，VCAM-1在Tsn組的表達為(18.29±2.52)%，較模型組降低(P＜0.05)。見圖1。

表1 各組血脂檢測結果(mmol/L，±s)

表1 各組血脂檢測結果(mmol/L，±s)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

TC TG LDL-C對照組組別 n 10 2.21±0.35 1.09±0.38 1.05±0.17模型組 10 28.29±0.871) 4.70±2.231) 9.32±0.291)Tsn組 10 22.54±1.431)2) 3.87±1.311)2) 8.52±0.511)2)

表2 各組主動脈內膜增生情況比較(±s)

表2 各組主動脈內膜增生情況比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.001;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n 管腔面積(×104μm2)新生內膜面積(×104μm2)內膜增生百分比(%)10 4.37±0.72 3.05±1.03 40.7±10.4模型組 10 2.56±0.251) 4.58±1.301) 63.2±7.41)Tsn組 10 3.96±0.452) 3.38±1.102) 45.2±8.92)對照組

圖1 主動脈VCAM-1的表達(DAB，×200)

3 討論

AS是血管內皮細胞、平滑肌細胞受到血脂異常、高血壓及病毒感染等多種損傷性因素直接作用后，出現內皮損傷，并導致過度炎癥性纖維增生性反應的結局。血漿中 TC、TG、LDL過高都是AS的危險因素。本實驗結果顯示，模型組大鼠經高脂飲食后，TC、TG、LDL-C顯著升高，主動脈可見明顯AS斑塊形成，病理切片見血管內皮下脂質浸潤等指標，證明本實驗AS模型已成功建立;Tsn不能降低大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，但該組主動脈內膜脂質斑塊面積較模型組有顯著性減少，病理切片顯示Tsn組主動脈內膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質沉積、散在的泡沫細胞和炎癥細胞，說明Tsn能顯著、有效地抑制動脈脂質沉著，阻止AS形成。

VCAM-1是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管內皮細胞表達，已知正常動脈內皮細胞不表達VCAM-1，當其受到炎癥介質或其他刺激時才會表達。VCAM-1參與了AS發(fā)生、發(fā)展全過程。在高血脂刺激AS形成過程中，VCAM-1早期表達，促使白細胞、巨噬細胞的活動性、黏附力和轉移力增強，使單核細胞黏附、遷移并轉化為巨噬細胞，攝取脂質轉化為泡沫細胞，同時還可促進T淋巴細胞及B淋巴細胞從血流中向內皮細胞的黏附〔2，4〕。硬化晚期，VCAM-1參與了局部炎癥的激化、巨噬細胞的活化與聚集、分泌基質金屬蛋白酶降解纖維帽的細胞外基質成分等過程〔5〕。抑制VCAM-1的表達，可以減輕或延緩AS病變的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。我們的研究發(fā)現，AS模型組主動脈可見大量VCAM-1陽性表達細胞，并且主要表達于病變血管的內皮及斑塊中，而Tsn能明顯抑制AS大鼠主動脈VCAM-1的表達，從而抑制了AS時炎癥細胞趨化、黏附與遷移，抑制AS時局部炎癥反應而達到防治AS的作用。

1 Galkina E，Ley K.Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis〔J〕.Annu Rev Immunol，2009;27(1):165-97.

2 Kaufmann BA，Sanders JM，Davis C，et al.Molecular imaging of inflammation in atherosclerosis with targeted ultrasound detection of vascular cell adhesion molecule-1〔J〕.Circulation，2007;116(3):276-84.

3 周明學，徐 浩，陳可冀.活血、益氣、化痰中藥對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2008;17(4):496-8.

4 Rueda-Clausen CF.Inflammation but not endothelial dysfunction is associated with the severity of coronary artery disease in dyslipidemic subjects〔J〕.Mediators Inflamm，2009;23(4):469-79.

5 Matheny HE，Deem TL，Cook-Mills JM.Lymphocyte migration through monolayers of endothelial cell lines involves VCAM-1 signaling via endothelial cell NADPH oxidase〔J〕.J Immunol，2000;164(12):6550-9.

6 Zhu LQ，Wang SR，Qin Y.Effects of huoxue injection on the adherence of human monocytes to endothelial cells and expression of vascular cell adhesion molecules〔J〕.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29(3):238-41.