周永剛，劉 暢，毛 飛，李 祥(.解放軍第8醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 000;.安捷倫公司，上海 0000;.北京兒童醫(yī)院藥劑科，北京 00056;.解放軍680部隊，北京 0007)

荷葉屬于睡蓮科植物蓮的干燥葉，分布于我國大部分地區(qū)，主產(chǎn)于湖南、湖北、浙江、江蘇等地［1］。荷葉味苦性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有清熱解暑、升發(fā)清陽、涼血止血等功效，主治暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏［2～5］。研究表明，荷葉中的生物堿和黃酮類化合物還具有降血脂、抑制膽固醇、抗有絲分裂、抑菌和止痙攣、抗氧化等活性［6～12］。目前國內(nèi)外學者采用傳統(tǒng)的植物化學的方法，對荷葉中生物堿、黃酮和揮發(fā)油進行了分離提?。?3，14］，顯然，這些傳統(tǒng)方法難以系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥中多類成分的復雜性。為了能夠?qū)扇~的藥效基礎(chǔ)作更好的闡述，本研究采用HPLC-TOF/MS技術(shù)對荷葉中多成分進行了鑒別，該法操作簡便、可靠，對闡明荷葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制具有一定的參考價值。

1 儀器和試藥

安捷倫1200型液相色譜儀，包括在線脫氣機，二元泵，高性能自動進樣器;安捷倫G6210A飛行時間質(zhì)譜儀，配有標準電噴霧離子源(ESI)，MassHunter色譜工作站和Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件。

荷葉購于上海雷允上大藥房，荷葉堿標準品購自中國生物制品檢定所，乙腈為色譜純(Fisher，USA)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 供試品溶液制備 用粉碎機將藥材荷葉均勻粉碎，取細粉約2 g(過40目篩)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放置冷卻，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SBAq C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈和1.0%醋酸(用氨水調(diào) pH 至6.2±0.1);A 相為乙腈，B相為1%醋酸，梯度洗脫;梯度洗脫程序如下:0～50 min，0～30%A;50～90 min，30% ～75%A;進樣量10 μl;流速:1.0 ml/min，柱溫:25 ℃。

2.2.2 TOF/MS質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，正離子模式下(ESI+)，柱后分流比為3∶1，具體參數(shù)如下:毛細管電壓4 000 V，霧化氣壓力40 psig，干燥氣流速10 ml/min，干燥氣溫度350℃，碎片電壓選擇120 V和200 V;參比離子m/z 121.050 8和922.009 7;質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100～1 000。

2.3 荷葉中化學成分數(shù)據(jù)庫的建立 根據(jù)有關(guān)荷葉藥材化學成分研究的報道，收集了生物堿類、黃酮類等化學成分共38個，并通過安捷倫“Formula-Database-Generator”軟件建立荷葉藥材中已知化學成分的數(shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果和討論

3.1 實驗條件優(yōu)化 首先考察了甲醇-水和乙腈-水兩種體系，結(jié)果顯示乙腈的洗脫效果要優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈作為有機相。由于荷葉中主要含有黃酮類成分和生物堿類成分，為保證生物堿類成分具有較好的峰形，所以在流動相中加入少量氨水。一般調(diào)pH值常用的試劑為三乙胺和氨水，但三乙胺在質(zhì)譜中有較大的殘留，多次進樣后會對定性鑒別產(chǎn)生較大的干擾，所以，選擇在流動相中添加氨水，避免殘留離子的干擾。同時，為了保證總離子流圖有較好的重現(xiàn)性，在每次配制流動相的時候控制水相的pH值為6.2±0.1。質(zhì)譜檢測分別比較了正、負離子兩種掃描模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正模式下峰容量更大、質(zhì)譜響應更強，故實驗最終選擇在正模式下進行。

3.2 荷葉中化學成分的鑒別 在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，荷葉提取液的HPLC-TOF/MS典型總離子流圖見圖1。從圖中看到有超過25個峰被檢測到，我們對其中的14個峰進行了詳細的鑒別。通過對比標準物質(zhì)的保留時間和質(zhì)譜圖，可以判定峰13為荷葉堿。其它化合物由于沒有標準品進行比對，按照以下方法鑒別:首先，我們根據(jù)TOF/MS上所得到的精確化合物分子量信息，通過MassHunter軟件在3 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計算其可能的元素組成，并將其與所建的數(shù)據(jù)庫相匹配，對荷葉化學成分的初步鑒別。然后，調(diào)節(jié)碎片電壓至200 V，獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中各化合物的化學結(jié)構(gòu)，對荷葉化學成分進行進一步的鑒別，結(jié)果見表1。

圖1 荷葉提取物TOF/MS總離子流圖

表1 荷葉化學成分鑒別結(jié)果

以峰1為例，來說明鑒別過程。在碎片電壓在120 V的條件下，得到其質(zhì)譜圖(圖2(a))，測得其分子離子峰為272.128 1，元素組成為C16H17NO3，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配我們初步鑒定該化合物為去甲基烏藥堿。調(diào)節(jié)碎片電壓至200 V，得到此電壓條件下的質(zhì)譜圖(圖2(b))，發(fā)現(xiàn)有很強的脫NH3(17 Da)的碎片離子，推測該碎片離子為其B環(huán)的Retro Diels-Alder(RDA)裂解碎片，這說明該結(jié)構(gòu)中的N上沒有甲基取代，然后根據(jù)質(zhì)譜圖上明顯的255.088 0［M-NH2］+、237.077 6［M-NH2-CO］+、209.085 7［M-NH2-CO-CO］+、164.058 1［MC7H8O］+、163.046 7［M-NH2-C6H6O］+和143.036 6［M-NH2-C6H8O2］+等碎片離子的信息，推斷出裂解途徑見圖3所示。結(jié)合以上信息，我們能夠鑒定峰1為去甲基烏藥堿。

圖2 120 V(A)與200 V去甲基烏藥堿(B)碎片離子質(zhì)譜圖

去甲基烏藥堿ESI-MS裂解途徑如下:

采用類似的方法，能夠?qū)Ψ?～14也進行相應的鑒別。峰2顯示的分子離子峰為286.143 3，分子式為 C17H19NO3，產(chǎn)生碎片離子 269.103 6［MNH2］+、237.077 1［M-NH2-CH3OH］+、209.081 1［M-NH2-CH3OH-CO］+、178.071 7［M-C7H8O］+和 175.061 0［M-NH2-C6H6O］+，故判斷其為烏藥堿;峰 3、4、6的分子離子峰分別為 300.160 3、300.159 4和300.159 5，三者具有相同的分子式C18H21NO3，其中峰3在200 V電壓下能夠產(chǎn)生碎片離子 269.104 4［M-NH2CH3］+、237.078 3［MNH2CH3-CH3OH］+、209.084 1［M-NH2CH3-CH3OH-CO］+和 192.088 8［M-C7H7O］+，峰 4 則另有特征性的碎片離子175.060 3［M-NH2CH3-C6H6O］+和 143.036 6［M-NH2CH3-C7H10O2］+，峰6所產(chǎn)生的碎片離子為 283.117 4［M-NH2］+、252.098 6［M-NH2-CH3OH］+、237.076 4［M-NH2-CH3OH-CH3］+、209.078 9［M-NH2-CH3OH-CH3-CO］+、192.086 4［M-C7H8O］+、189.075 6［MNH2-C6H6O］+，根據(jù)三者所具有的碎片離子的不同，判斷峰3為N-甲基異烏藥堿，峰4為N-甲基烏藥堿，峰6為N-去甲亞美罌粟堿;峰5的分子離子峰為465.103 6，化學式為 C21H20O12，產(chǎn)生的碎片離子為 377.120 8［M-C5H10O］+、303.052 4［MC6H10O5］+，根據(jù)裂解規(guī)律判斷為異槲皮苷;峰7的分子離子峰為286.143 2，化學式為C17H19NO3，產(chǎn)生碎片離子 269.103 6［M-NH2］+、254.079 3［M-NH2CH3］+、237.076 3［M-NH2-CH3OH］+和209.081 4［M-NH2-CH3OH-CO］+，判斷為 N-去甲甲基烏藥堿;峰8的分子離子峰為314.176 4，化學式為 C19H23NO3，產(chǎn)生的碎片離子為283.117 6［M-NH2CH3］+，、252.098 2［M-NH2CH3-CH3OH］+和206.111 3［M-C7H8O］+，判斷峰 8 為亞美罌粟堿;峰9和峰10的分子離子峰為 282.150 7和282.148 9，共同的元素組成C18H19NO2，峰9有很強的-31 的251.106 9［M-NH2CH3］+碎片離子，推測此結(jié)構(gòu)的氮原子上有甲基取代，峰10則有很強的-17的265.122 2［M-H2NH］+碎片離子，推測該碎片離子為其B環(huán)的RDA裂解碎片，而該結(jié)構(gòu)中N上沒有甲基取代，根據(jù)分析和數(shù)據(jù)庫匹配，判斷峰9為O-去甲基荷葉堿，峰10為 N-去甲基荷葉堿;峰11的分子離子峰為266.227 6，化學式為C17H15NO2，產(chǎn)生碎片離子 249.091 0［M-H2NH］+、219.080 4［MH2NH-CH2O］+、191.085 3［M-H2NH-CH2O-CO］+，判斷為番荔枝堿;峰12的分子離子峰為312.150 9，化學式為 C19H21NO3，其碎片離子為 283.125 3［MCO］+、269.108 8［M-CH2CH2NH］+、251.098 0［MCO-CH3NH2］+、254.087 1［M-CH2CH2NH-CH3］+、225.185 5［M-CH2CH2NH-CH3-CO］+，判斷其原荷葉堿;峰14的分子離子峰為280.133 8，化學式為C18H17NO2，產(chǎn)生碎片離子249.083 1［MNH2CH3］+、219.072 2［M-NH2CH3-CH2O］+和191.077 2［M-NH2CH3-CH2O-CO］+，根據(jù)裂解情況推斷其為斑點亞洲罌粟堿。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC－TOF/MS技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配技術(shù)和碎片離子分析，對荷葉中的主要化學成分進行了鑒別，共確定了14個荷葉中的主要生物堿類和黃酮類成分。利用TOF/MS在高碎片電壓下產(chǎn)生的豐富的碎片離子信息，進一步明確鑒別了一系列非靶標成分，并總結(jié)了荷葉中化學成分的一般裂解規(guī)律。該方法快速，靈敏，準確度高，可作為荷葉質(zhì)量控制的方法之一，同時為荷葉的藥理學和臨床藥效學研究提供了化學物質(zhì)基礎(chǔ)信息。

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