胡永勝，肖 瑩，邸 鵬，張 磊，陳萬生(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 0003;.第二軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室，上海 00433;3.第二軍醫(yī)大學(xué)現(xiàn)代中藥研究中心，上海 00433;4.解放軍第118醫(yī)院藥械科，浙江 溫州 35000)

木質(zhì)素(lignin)是一種由肉桂醇等單體聚合而成的酚類多聚體，是維管植物細(xì)胞壁的重要組成成分［1，2］。木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵結(jié)合，具有加固細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，增強(qiáng)植物的抗倒伏性，提高植物細(xì)胞運(yùn)輸能力以及抵御病原菌微生物侵害的生物學(xué)功能［3］。木質(zhì)素在造紙業(yè)制漿、飼料易消化性、植物燃料等方面有著廣泛的研究需求，急需解決的難題是，如何減少植物中木質(zhì)素的含量或者改變其種類使之容易降解。在過去的二十年間，越來越多的研究基于調(diào)控木質(zhì)素單體次生代謝通路中某個(gè)基因的表達(dá)，來改變木質(zhì)素的含量與組成，以及改良植物的應(yīng)用特性。本文對(duì)近年來在木質(zhì)素次生代謝工程方面的新概念、新趨勢，以及木質(zhì)素研究中的系統(tǒng)生物學(xué)做一簡要綜述。

1 木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及生源合成途徑

木質(zhì)素是一類組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的高分子量肉桂醇脫氫聚合物，其單體主要有對(duì)-香豆醇(ρcoumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)與芥子醇(sinapyl alcohol)［1］。裸子植物中木質(zhì)素主要為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guaiacyl lignin，簡稱G型)，由松柏醇聚合而成，而被子植物木質(zhì)素主要為G型和紫丁香基木質(zhì)素(syringyl lignin，簡稱S型)，分別由對(duì)-香豆醇和芥子醇聚合而成。單子葉植物中木質(zhì)素除了 G型和 S型外，還有對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素(hydroxyphenyl lignin，簡稱 H型)，由對(duì)-香豆醇聚合而成。

植物中木質(zhì)素單體的生源合成途徑已經(jīng)探明(圖 1)［4，5］，木質(zhì)素合成以苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)催化苯丙氨酸脫氨形成肉桂酸起始，再經(jīng)肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)催化生成對(duì)香豆酸，4-香豆酸:輔酶A連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase，4CL)催化對(duì)香豆酸生成對(duì)香豆酰輔酶A，在莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(ρ-hydroxycinnamoyl-CoA:quinate shikimate ρ-hydroxycinnamoyl-transferase，HCT)與香豆酸-3-羥基化酶(Coumarate 3-hydroxylase，C3H)的催化下生成咖啡酰輔酶A，在咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeic acid/5-hydroxyconiferaldehyde O-methyltransferase，COMT)催化下發(fā)生甲基化，及在阿魏酸-5-羥基化酶(Ferulate-5-hydroxylase，F(xiàn)5H)催化下羥基化，經(jīng)肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)催化還原成相應(yīng)的肉桂醛，最終經(jīng)肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)還原為3種肉桂醇，它們分別是對(duì)-香豆醇(ρ-Coumaryl alcohol)、松柏醇(Coniferyl alcohol))和芥子醇(Sinapyl alcohol)。然后三種木質(zhì)素單體在某種機(jī)制下轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁，在過氧化酶(Peroxidase)和漆酶(Laccase)的作用下脫氫聚合成木質(zhì)素。研究表明，H/G/S型木質(zhì)素的含量可以被調(diào)控。HCT、C3H低表達(dá)會(huì)使在天然木質(zhì)素占較小比例的H型木質(zhì)素增多［6，7］;F5H低表達(dá)則會(huì)使木質(zhì)素主要為G型，高表達(dá)主要S型;COMT低表達(dá)會(huì)減少S型木質(zhì)素的比例，同時(shí)使木質(zhì)素中5-羥基松柏醇的含量增多;CAD的低表達(dá)會(huì)使天然木質(zhì)素中肉桂醛的含量增多［1，8］;這些都佐證了木質(zhì)素單體的生源合成途徑。

圖1 木質(zhì)素的生源合成途徑

2 相關(guān)酶基因的研究進(jìn)展

2.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是木質(zhì)素單體生源合成中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，是木質(zhì)素單體化合物生源合成途徑的起始，是整個(gè)苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶［9］。植物中PAL一般認(rèn)為屬于多基因家族，至少有3到4個(gè)亞型［10］。PAL參與植物應(yīng)激與防御生理，是最早被鑒定的植物防御性基因之一，受病原和環(huán)境脅迫等因素誘導(dǎo)表達(dá)［11］。

2.2 肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)屬于細(xì)胞色素單加氧酶P450超家族，是公共苯丙烷途徑中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，催化反式肉桂酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥基肉桂酸。利用反義技術(shù)將C4H酶活性抑制后，轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素含量明顯減少，調(diào)控該基因的表達(dá)還可以改變木質(zhì)素的構(gòu)成。通過上調(diào)C4H的表達(dá)，促進(jìn)木質(zhì)素、防衛(wèi)性植保素的合成，可以增強(qiáng)植物的抗病性、抗逆性和抗倒伏性。C4H處于木質(zhì)素整個(gè)代謝途徑的較上游，與PAL、4CL 2個(gè)酶組成苯丙烷類代謝公共途徑，是調(diào)控木質(zhì)素生源合成的重要酶基因。

2.3 4-香豆酸 輔酶A連接酶(4CL)是苯丙烷代謝途徑的最后一個(gè)酶，在苯丙烷代謝途徑中處于終端位置，催化4-香豆酸生成4-香豆酰輔酶A，后者是多個(gè)代謝途徑的重要前體，繼而合成植物體內(nèi)重要的多種天然產(chǎn)物，如黃酮、類黃酮、木質(zhì)素、色素、芪類以及其它酚酸類化合物［12］。這些次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)起著重要的作用，如黃酮是防止紫外對(duì)植物的損傷，或者作為花粉發(fā)育和植物與微生物相互作用的信號(hào)分子;芪類可以保護(hù)植物細(xì)胞抗病蟲侵襲;木質(zhì)素是具有多種藥理活性的物質(zhì)，具有重要的藥用價(jià)值。已有開展4CL轉(zhuǎn)基因的報(bào)道，如利用反義技術(shù)抑制了楊樹中4CL酶的活性，使轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)素含量降低50%，纖維素提高了15%，而木質(zhì)素的成分和纖維素的形態(tài)沒有變化［13］。

2.4 莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)、香豆酸-3-羥基化酶(C3H)共同作用下將底物4-香豆酰輔酶A酯的3位羥基化。HCT與C3H的作用有協(xié)同效應(yīng)，HCT屬于轉(zhuǎn)移酶系，催化莽草酸/奎寧酸與4-香豆酰輔酶A酯發(fā)生轉(zhuǎn)移置換，其產(chǎn)物為香豆?？鼘幩岷拖愣辊ＣР菟?。C3H屬于P450氧化酶系，CYP98A3基因編碼C3H，實(shí)驗(yàn)證明C3H對(duì)香豆?？鼘幩岷拖愣辊ＣР菟岜憩F(xiàn)出很高的催化活性［14］。以后又從火炬松(AAV36 223.1)、落葉松(ACA35 323.1)中分離得到C3H。

2.5 肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是木質(zhì)素特異合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，可催化3種羥基肉桂酸的輔酶A酯的還原成相應(yīng)的肉桂醛。苯丙烷公共途徑可以產(chǎn)生黃酮、類黃酮、原花青素、木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物，CCR催化生成木質(zhì)素特異合成途徑是一個(gè)分支途徑，CCR可能對(duì)木質(zhì)素合成途徑的碳流具有潛在的調(diào)控作用，對(duì)木質(zhì)素單體的生源合成起著重要作用。

2.6 肉桂醇脫氫酶(CAD)催化肉桂醛生成肉桂醇，處于對(duì)-香豆醇、松柏醇和芥子醇生源合成最終位置，是木質(zhì)素單體生源合成途徑的關(guān)鍵酶基因。已經(jīng)從多種植物中分離得到肉桂醇脫氫酶基因，例如歐洲云杉(AJ868 574)、藍(lán)桉(AF038 561)、黑麥草(AJ585 090)、柳葉桉(AF294 793)、草莓(U63 534)、美洲山楊(AF217 957)、甘蔗(AJ231 135)和紫花苜蓿(Z19 573)。

2.7 咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)都是底物甲基化酶，木質(zhì)素單體生源合成需經(jīng)3'和5'位置的兩步甲基化反應(yīng)，COMT與CCoAOMT是兩個(gè)不同底物水平上的甲基化酶，與木質(zhì)素單體的特異合成有關(guān)。COMT催化S型木質(zhì)素單體合成，是S型木質(zhì)素單體合成的重要的調(diào)控基因［15］。CCoAOMT則是催化G型木質(zhì)素單體合成，是G型木質(zhì)素單體合成的重要調(diào)控基因［3］。COMT與CCoAOMT基因調(diào)控在S/G型木質(zhì)素比例的基因調(diào)控中具有重要的意義。

2.8 阿魏酸-5-羥基化酶(F5H)隸屬于細(xì)胞色素P450酶系，催化阿魏酸5位羥基化。研究表明，缺乏F5H活性的擬南芥fah1突變體重幾乎全部為G型木質(zhì)素;相應(yīng)地，過量表達(dá)F5H的轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草和楊樹中S型木質(zhì)素的含量顯著增加，G型木質(zhì)素相對(duì)減少［16，17］。可以推測，F(xiàn)5H 是 G 型與S型木質(zhì)素的生源合成途徑上重要的導(dǎo)向性調(diào)控基因。

2.9 過氧化酶、漆酶可以有效地催化木質(zhì)素單體脫氫聚合形成木質(zhì)素。最初證明漆酶在有氧條件下能夠催化產(chǎn)生木質(zhì)素，以后又發(fā)現(xiàn)過氧化酶也可有效催化木質(zhì)素的聚合反應(yīng)。

3 木質(zhì)素系統(tǒng)生物學(xué)研究

對(duì)木質(zhì)素突變體的轉(zhuǎn)錄水平及代謝特征的研究表明，木質(zhì)素生源合成途徑中任何一個(gè)基因的表達(dá)改變都會(huì)對(duì)植物的次生代謝產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

首先，木質(zhì)素次生代謝通路中某個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)，或多或少地會(huì)影響到該基因家族中的基因或是木質(zhì)素代謝通路中的相關(guān)基因的表達(dá)［18，19］。整個(gè)代謝通路是一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，局部的改變會(huì)影響到整個(gè)代謝流的變化。

其次，越來越多的研究表明，木質(zhì)素的次生代謝與參與植物細(xì)胞壁形成的其它多聚物具有重要的聯(lián)系［20，21］。例如，CCR 低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中，與前期的木質(zhì)素次生代謝研究結(jié)論相同，木質(zhì)素含量減少了;然而通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)分析表明，CCR的低表達(dá)也能導(dǎo)致植物細(xì)胞中木糖的合成量減少［22］。因此，探究木質(zhì)素途徑中基因的功能多樣性與植物細(xì)胞壁的形成特性之間的關(guān)系，對(duì)闡述植物細(xì)胞壁的屬性及如何改造植物便于農(nóng)業(yè)、工業(yè)應(yīng)用，具有重要的意義。

第三，采用系統(tǒng)生物學(xué)方法提示了木質(zhì)素次生代謝與環(huán)境代謝之間的互動(dòng)性，例如研究植物的正常代謝及在環(huán)境脅迫下應(yīng)激代謝［23］。如CCR低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，淀粉代謝及光呼吸作用增強(qiáng)，釋放的二氧化碳增多，體內(nèi)的碳?xì)浠衔锵脑龆啵?4］。深入研究木質(zhì)素次生代謝工作調(diào)控中的植物分子生理學(xué)響應(yīng)，有利用采用基因工程策略(如基因疊加技術(shù))來消除這些不良的應(yīng)激反應(yīng)［25］。

第四，對(duì)木質(zhì)素突變體植株的轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)了一些新基因，其功能與木質(zhì)素的次生代謝有重要關(guān)聯(lián)。各種各樣的轉(zhuǎn)錄譜研究表明，有大量的調(diào)控基因參與木質(zhì)素的次生代謝過程［22，26］，但得到確證的基因數(shù)量還不多。然而可以確信的是MYB和LIM家族的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物中木質(zhì)素次生代謝途徑中基因具有間接的調(diào)控作用，是一類重要的調(diào)控因子。

4 木質(zhì)素調(diào)控新策略

植物木質(zhì)素生源合成調(diào)控的研究熱點(diǎn)在于如何使木質(zhì)素更易于去除，從而利于造紙業(yè)制漿、飼料易消化性、植物燃料等方面的應(yīng)用。參與木質(zhì)素合成的酶有許多，常規(guī)的調(diào)控方法在于獲得該途徑上的酶基因，隨后構(gòu)建其表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，最后采用分析技術(shù)監(jiān)測木質(zhì)素含量及組成的變化。此類方法的弊端在于植物體內(nèi)的代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，單轉(zhuǎn)高表達(dá)某個(gè)基因的作用可能并不明顯。近年來，出現(xiàn)了以轉(zhuǎn)錄因子為研究對(duì)象的新的調(diào)控策略。

木質(zhì)素生源合成途徑中基因的AC因子發(fā)現(xiàn)有與玉米MYB相關(guān)P蛋白結(jié)合位點(diǎn)CCT/AACC。此外，金魚草的MYB305可以與AC因子結(jié)合，因而能激活扁豆PAL2的啟動(dòng)子中AC因子序列，上調(diào)PAL2 的表達(dá)［27，28］。可以推論，木質(zhì)素生源合成途徑的基因調(diào)控中，與AC因子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子也是MYB蛋白。對(duì)金魚草中的MYB308蛋白和MYB330蛋白研究表明MYB蛋白參與調(diào)控木質(zhì)素的生源合成［29］。在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)金魚草MYB蛋白，能夠下調(diào)木質(zhì)素途徑中的基因的表達(dá)和減少木質(zhì)素的含量，提示金魚草MYB蛋白可以調(diào)控木質(zhì)素生源合成。此后，從擬南芥［30］中獲得許多的MYB蛋白，過量表達(dá)這些MYB蛋白也能改變苯丙素的次生代謝途徑。Kawaoka等［31］報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子LIM1對(duì)木質(zhì)素的生物合成也具有重要的調(diào)控作用，利用反義技術(shù)構(gòu)建的擬南芥植株NtLIM1突變體，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素途徑中相關(guān)合成酶的轉(zhuǎn)錄處于較低的水平，總木質(zhì)素的含量下降了27%。以轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控可以在代謝途徑中的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用，與傳統(tǒng)單一位點(diǎn)調(diào)控措施相比，具有更好的調(diào)控效果。

5 植物木質(zhì)素的研究展望

近年來伴隨植物新能源的研究逐漸深入，木質(zhì)素日益成為研究重點(diǎn)。木質(zhì)素的代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，人們對(duì)其代謝通路確證經(jīng)過多次修正，木質(zhì)素單體的結(jié)構(gòu)類型也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止3種類型。木質(zhì)素作為植物對(duì)抗外界環(huán)境脅迫的重要的抗逆物質(zhì)，在植物的正常發(fā)育中具有重要的作用，在對(duì)木質(zhì)素次生代謝工程調(diào)控時(shí)需要考慮到對(duì)植物生理的影響。木質(zhì)素系統(tǒng)生物學(xué)是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，采用系統(tǒng)論的觀點(diǎn)，綜合考慮了木質(zhì)素次生代謝各種影響因素，利用傳統(tǒng)的基因過量或抑制表達(dá)具有一定的局限性，采用RNAi和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控手段來進(jìn)行植物木質(zhì)素次生代謝工程調(diào)控將是大勢所趨。

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