孫 霽，陳 琰，魯 瑩，鐘延強(qiáng)(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

作為非病毒基因載體之一，陽(yáng)離子脂質(zhì)體由于其較高的基因攜載能力和細(xì)胞攝取率而受到青睞。但由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶有大量正電荷，血循環(huán)中容易與體環(huán)境中的聚陰離子發(fā)生反應(yīng)，從而引起較大的細(xì)胞毒性［1～3］。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)冒赓|(zhì)粒(plasmid，pDNA)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞［4］，考察細(xì)胞毒性，從而為雙脂質(zhì)體復(fù)合物用于基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3β-［N-(N'，N'-二甲氨基乙基)］氨甲?；?膽固醇(DC-Chol)(美國(guó)Avanti Polar Lipids公司)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(德國(guó)Lipoid公司)，膽甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)(美國(guó)Sigma公司)，無(wú)血清培養(yǎng)基 MEM(美國(guó) Hyclone公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)粉末(美國(guó)Sigma公司)，pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒(上海吉瑪制藥)，HepG2細(xì)胞(中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.2 儀器 R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)，LF-1薄膜擠出器(加拿大Avestin公司)，Zeta Sizer Nano ZS激光粒度分析儀(英國(guó)Malvern公司)，XW-80型渦旋混合器(上海第一醫(yī)學(xué)儀器廠)，F(xiàn)A1004萬(wàn)分之一天平(上海天平儀器廠)，凝膠成像儀(上海復(fù)日科技有限公司)。

1 方法

2.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備 精密稱(chēng)取適量脂質(zhì)體膜材料(3β-［N-(N'，N'-二甲氨基乙基)］氨甲?；?膽固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺)，按摩爾比1∶1混合后溶于適量氯仿中，將該溶液加入到梨形燒瓶，充氮?dú)?次，減壓旋蒸12 h除去氯仿，得到干燥脂質(zhì)薄膜。加入一定體積的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(20 mM，pH7.4)，緩緩震搖，將脂質(zhì)薄膜從瓶壁洗下，得到脂質(zhì)體混懸液，使充分水合后，通過(guò)薄膜擠出器分別通過(guò)400、200、100 nm聚碳酸酯膜，各10遍，即得陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

2.2 陰離子脂質(zhì)體制備 精密稱(chēng)取適量脂質(zhì)體膜材料(膽甾醇半琥珀酸酯、二油酰磷脂酰乙醇胺)，按摩爾比4∶6混合后溶于適量氯仿中，將該溶液加入到梨形燒瓶，充氮?dú)?次，減壓旋蒸除去氯仿，真空維持12 h，得到干燥的脂質(zhì)薄膜，加入以一定體積的20 mMHEPES緩沖液(pH7.4)，緩緩震搖，將脂質(zhì)薄膜從瓶壁洗下，得到脂質(zhì)體混懸液，使充分水合后，通過(guò)薄膜擠出器分別通過(guò)400、200、100 nm聚碳酸酯膜，各10遍，即得陰離子脂質(zhì)體。

2.3 pDNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備 取1 μg質(zhì)粒用HEPES緩沖液稀釋至20 μl，靜置5 min。取一定體積的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，用緩沖液稀釋至20 μl，靜置5 min。然后兩者混合，靜置25 min按材料中正電荷與質(zhì)粒負(fù)電荷比為4(n/p=4)的要求制備pDNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

2.4 陰離子脂質(zhì)體－陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的制備取一定體積陰離子脂質(zhì)體，用HEPES緩沖液稀釋至20 μl，與“2.3”中制備的pDNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體渦旋滴加復(fù)合，靜置25 min。按照不同正負(fù)電荷比(+/－ =1/0.5，1/1，1/1.5，1/2，1/2.5，1/3)的要求，制備陰離子脂質(zhì)體-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。

2.5 復(fù)合物的表征 取10 μl正負(fù)電荷比為1/1的復(fù)合物于云母片上，在掃描頻率為1 Hz，掃描范圍為2.5 μm ×2.5 μm 的條件下進(jìn)行原子力掃描，觀察復(fù)合物形態(tài)特征。

2.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取適量瓊脂糖，加入約100 ml電泳緩沖液，加熱溶解，配制1.0%瓊脂糖凝膠溶液，室溫冷卻至約60℃，加入5 μl溴化乙錠溶液(500 μg/ml)插入 DNA染色，灌膠。將“2.4”中制備的復(fù)合物加入孔道中，在緩沖液中以80 V電壓泳動(dòng)50 min后，用全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置進(jìn)行觀察。

2.7 復(fù)合物zeta電位測(cè)定 分別取“2.4”中制備的復(fù)合物50 μl用去離子水稀釋至1 ml后加入樣品池進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取肝癌HepG2細(xì)胞在含有10%胎牛血清、非必需氨基酸的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5%CO2、37℃培養(yǎng)箱)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用MEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)疵靠?×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)(5%CO2、37℃培養(yǎng)箱)預(yù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，將“2.4”中制備的復(fù)合物依次加入培養(yǎng)孔中，37℃孵育5～6 h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍后每孔加入等體積含血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，重懸于PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

2.9 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將“2.4”中制備的復(fù)合物加入96板孔中，5%CO2，37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μl溴化四唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合物zeta電位 zeta電位可以用來(lái)衡量微粒體系表面帶電情況，陰離子脂質(zhì)體－陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的zeta電位明顯低于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的zeta電位，說(shuō)明陰離子脂質(zhì)體的加入能有效降低復(fù)合物的表面電位。剛加入陰離子脂質(zhì)體時(shí)，其復(fù)合物zeta電位下降趨勢(shì)明顯;隨著陰離子脂質(zhì)體加入量不斷越多，其復(fù)合物zeta電位下降趨勢(shì)平緩。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同處方復(fù)合物的zeta電位

3.2 原子力掃描圖 從圖2可看出復(fù)合物呈圓球形，粒徑在200～300 nm。

圖2 復(fù)合物的原子力掃描圖

3.3 質(zhì)粒包封情況 陽(yáng)離子脂質(zhì)體能中和核酸的負(fù)電荷，因此當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物形成后，核酸在瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)能力大大減少甚至喪失，在紫外燈下無(wú)法觀察到白色亮條帶。陰離子脂質(zhì)體－陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的質(zhì)粒包封情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，未被載體包裹的裸質(zhì)粒DNA在紫外燈下可見(jiàn)白色亮條帶，僅被陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒DNA未見(jiàn)白色亮條帶，而被不同陰離子脂質(zhì)體－陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物包裹的質(zhì)粒DNA也均未見(jiàn)白色條帶。說(shuō)明與陽(yáng)離子脂質(zhì)體一樣，陰離子脂質(zhì)體－陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物可以將質(zhì)粒完全包裹。

圖3 不同比例復(fù)合物的質(zhì)粒包封情況

3.4 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 轉(zhuǎn)染效率高低是衡量基因載體的重要指標(biāo)之一，良好的基因載體應(yīng)具有較高的轉(zhuǎn)染效率。如圖4所示，復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率均沒(méi)有陽(yáng)離子脂質(zhì)體(電荷比(+/－)=1/0)轉(zhuǎn)染效率高，其中正負(fù)電荷比為1/0.5的復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率最接近;隨著復(fù)合物中陰離子脂質(zhì)體比例的增加，轉(zhuǎn)染效率呈下降趨勢(shì)，表明陰離子脂質(zhì)體的加入對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定影響。

圖4 不同處方復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率

3.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 理想的基因載體除了要有較高的轉(zhuǎn)染效率外，還應(yīng)具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞的毒性相對(duì)較低。如果載體的細(xì)胞毒性過(guò)大，就可能會(huì)降低其轉(zhuǎn)染效率，從而影響目的基因的表達(dá)。如圖5所示，復(fù)合物的細(xì)胞毒性均小于陽(yáng)離子脂質(zhì)體(電荷比(+/－)=1/0)的細(xì)胞毒性，說(shuō)明陰離子脂質(zhì)體的加入能一定程度上降低細(xì)胞毒性;復(fù)合物正負(fù)電荷比為1/1.5～1/2.0范圍時(shí)，細(xì)胞成活率最高;隨著陰離子脂質(zhì)體的加入量不斷增大，其細(xì)胞成活率呈下降趨勢(shì)。

圖5 不同處方復(fù)合物的細(xì)胞生存率

4 討論

陽(yáng)離子是目前公認(rèn)的轉(zhuǎn)染效率較高的非病毒載體之一，而且由于其表面帶有大量正電荷，因此產(chǎn)生較大的細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中加入一定量的陰離子脂質(zhì)體，有效降低了陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面電荷量。通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陰離子的加入并沒(méi)有影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)質(zhì)粒的攜載能力，質(zhì)粒仍完全包封在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰離子脂質(zhì)體對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率有一定降低作用，這是由于復(fù)合物的表面電荷沒(méi)有單純陽(yáng)離子脂質(zhì)體的高，影響了粒子與細(xì)胞膜的結(jié)合能力［5］，從而降低了轉(zhuǎn)染效率。但是，正是由于復(fù)合物表面的低電荷，使得其細(xì)胞毒性小于陽(yáng)離子脂質(zhì)體;當(dāng)然，陰離子脂質(zhì)體本身也會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，因此，復(fù)合物正負(fù)電荷比在某一范圍時(shí)呈現(xiàn)出最小的細(xì)胞毒性，隨著陰離子脂質(zhì)體比例繼續(xù)增加，復(fù)合物的毒性增大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，與陰離子脂質(zhì)體復(fù)合后使陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性降低，同時(shí)雙脂質(zhì)體復(fù)合物能保持質(zhì)粒的包封以及對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，為陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)改造提供新的可行性。

［1］Marika R，Markku T，Urtti A.Cell-surface glycosaminoglycans inhibited cation-mediated gene transfer［J］.J Gene Med，2004，6(4):405.

［2］Reinisalo M，Ruponen A，Urtti A.Polyplex-mediated gene transfer and cell cycle:effect of carrier on cellular uptake and intracellular kinetics and significance of glycosaminoglycans［J］.J.Gene Med，2007，9(6):479.

［3］Charudharshini S，Diane B.Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery［J］.J.Controlled Release，2009，136(1):62.

［4］Mignet N，Richard C，Scherman D，et al.Anionic pH-sensitive pegylated lipoplexes to deliver DNA to tumors［J］.Int J Pharm，2008，361(1-2):194.

［5］Julia Lehtinen，et al.Glycosaminoglycan-resistant and pH-sensitive lipid-coated DNA complexes produced by detergent removal method［J］.J.Controlled Release，2008，131(2):145.