章 巍，董 蔚，平其能

中國藥科大學(xué)藥劑教研室，南京 210009

依托泊苷（etoposide，VP-16）為鬼臼毒素的半合成產(chǎn)物，屬于細(xì)胞周期特異性抗癌藥物，可能通過直接激活某些內(nèi)切酶或通過其代謝物作用于S期、G2期的細(xì)胞，使細(xì)胞分化阻滯于G2期，并與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合形成藥物-酶-DNA三者之間穩(wěn)定的可裂性復(fù)合物，干擾DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，致使受損的DNA不能修復(fù)[1]。目前，依托泊苷是臨床上治療小細(xì)胞肺癌、惡性淋巴瘤和睪丸癌的常規(guī)用藥，同時(shí)也可用于治療急性粒細(xì)胞白血病、子宮癌和乳腺癌等多種腫瘤疾病。依托泊苷在水中的溶解度低，37℃時(shí)溶解度為 148～153μg·mL-1， 無法滿足100 mg/片的劑量溶出時(shí)的釋藥條件；其特性溶出速率每平方厘米僅為0.01 mg·min-1，故溶出過程是其吸收的限速過程之一[2]。自微乳制劑口服后遇體液在胃腸蠕動(dòng)下自發(fā)分散成O/W型微乳。由于微乳粒徑小，藥物在其中的分散度好，有利于藥物的吸收，可以提高藥物在體內(nèi)的生物利用度[3]。與傳統(tǒng)的自微乳化制劑相比，固體自微乳制劑具有穩(wěn)定性增加、貯存時(shí)間延長、胃腸道刺激性減少、服用方便等優(yōu)點(diǎn)，并可通過添加各種固體輔料或采用包衣技術(shù)方便地制備緩控釋制劑，對(duì)難溶性藥物而言，是一個(gè)極具開發(fā)前景的新型制劑[4]。

目前國內(nèi)外上市的依托泊苷制劑品種主要有注射液和口服軟膠囊。VP-16注射液較易引起血液系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等不良反應(yīng)，且不宜靜脈推注，靜滴時(shí)速度不能過快，否則容易引起低血壓、喉痙攣等過敏反應(yīng)；而VP-16軟膠囊內(nèi)容物加水稀釋后即析出大量沉淀[5]，制劑穩(wěn)定性有待加強(qiáng)，因此筆者以水難溶性藥物依托泊苷為模型制備了具有自乳化性質(zhì)的固體顆粒，對(duì)其體外溶出進(jìn)行了考察，并對(duì)VP-16固體自微乳制劑的大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了初步的研究。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

依托泊苷原料藥（齊魯制藥有限公司）；市售依托泊苷軟膠囊（批號(hào):100801，連云港恒瑞制藥有限公司）；注射用中鏈油（MCT）、長鏈油（LCT）均購自德國lipoid公司；注射用大豆油（批號(hào):101013，鐵嶺北亞藥用油有限公司）；Cremophor?RH40、Cremophor?E L（德國 BASF公司）；吐溫 80（批號(hào):F 20080203）、微粉硅膠均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇（PEG400，汕頭市西隴化工廠有限公司，批號(hào)0903041）；甲醇（色譜純）；醋酸鹽緩沖液（自配）；其他試劑均為分析純；蒸餾水（自制）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Shimadz uL C-10AT）；迪馬Diamonsil?C18色譜柱（250mm×4.6m m，5μm）；ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀 （天津大學(xué)無線電廠）；粒度/Zeta電位測(cè)定儀（Marvern Instruments Ltd UK）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康 Sprague-Dawley大鼠，雄性，體重 200～250g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；合格證號(hào)SCXK（蘇）2009-0034；飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，照明時(shí)間為每天 12h。

2 方法和結(jié)果

2.1 VP-16固體自微乳制劑的處方及制備工藝研究

2.1.1 VP-16溶解度測(cè)定 油相選用 LCT、MCT、大豆油；表面活性劑分別選用Cremophor?EL、Cremophor?R H 40、吐溫80；助表面活性劑選用丙二醇、聚乙二醇。測(cè)定其飽和溶解度，具體方法為:分別稱取上述物質(zhì)各2 g，加入過量的V P-16，室溫?cái)嚢?8 h后，3000 r·min-1離心 20min，取上清液 100μL用1000μL甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，H P L C法進(jìn)樣分析，計(jì)算其飽和溶解度。

由表1結(jié)果可見，就油相而言，大豆油屬長鏈油，雖然溶解度尚可，但較難微乳化。VP-16在LCT中的溶解度優(yōu)于MCT，但由于LCT的粘度較大和乳化能力有限，因此選擇使用粘度較小、對(duì)藥物增溶效果好的MCT作為SSMEDDS的油相。表面活性劑中Cremphor?RH40對(duì)藥物的增溶效果最佳。助表面活性劑中PEG400對(duì)VP-16的增溶效果最好，平衡溶解度可達(dá)177.588 mg·mL-1。綜上所述，油相選擇MCT，表面活性劑選擇Cremphor?RH40，助表面活性劑選擇PEG400進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

表1 VP-16在不同介質(zhì)中的溶解度

2.1.2 VP-16自微乳偽三元相圖的繪制 將“2.1.1”項(xiàng)下篩選的油相（MCT）、表面活性劑（Cremphor?RH40）和助表面活性劑（PEG400）在不同混合比例下采用滴定法繪制偽三元相圖。將Cremphor?RH40和PEG400按照一定的質(zhì)量比混合，作為Km值（表面活性劑∶助表面活性劑），再和油相按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 的比例混合均勻，在攪拌狀態(tài)下用37℃的蒸餾水進(jìn)行滴定，肉眼觀察，以形成帶有藍(lán)色乳光的液體為臨界點(diǎn)，記錄加入蒸餾水的量，按照Km、油相和水相在臨界點(diǎn)時(shí)各自的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w/w），用Origin軟件繪制偽三元相圖，確定自微乳化的區(qū)域。

由圖1可見，Km越大形成微乳的范圍越廣。但是Km逐漸增大，體系中的表面活性劑比例增加，在滴定過程中會(huì)出現(xiàn)粘度較大的液晶態(tài)，大大延緩體系的自乳化效率。根據(jù)偽三元相圖的結(jié)果將自微乳處方中的Km值定為4∶1，油相的用量為乳化劑和助乳化劑總量的10%。

圖1 偽三元相圖的制備及自乳化區(qū)域的確定

2.1.3 VP-16自微乳的粒徑考察 按照前期處方優(yōu)化結(jié)果，稱取一定量的MCT、Cremphor?RH40、PEG400混合均勻，再按處方量比例稱取VP-16原料藥置于混合油相中，在70℃水浴中加熱并攪拌，使藥物完全溶解，放涼至室溫即得VP-16自微乳溶液。

以蒸餾水為稀釋介質(zhì)，將VP-16自微乳最優(yōu)處方稀釋100倍后形成的微乳，測(cè)定其粒徑和Zeta電位，測(cè)得3組微乳處方中，平均粒徑最小的為（21.8±1.5）nm，多分散指數(shù)為 0.359±0.009。

2.1.4 固體吸附材料的選擇 在PEG6000、乳糖、微晶纖維素（MCC PH101）、甘露醇、檸檬酸和微粉硅膠等常用水溶性和水不溶性固體吸附材料中，以最大吸附量作為考察指標(biāo)，選擇依托泊苷自微乳的固體吸附劑。具體方法:分別稱取1 g不同種類的固體吸附材料，逐滴加入液體自微乳，邊加邊混合均勻，使得藥液完全吸收成為干燥的粉末，當(dāng)粉末稍有潮濕時(shí)，認(rèn)為已經(jīng)達(dá)到吸附飽和，記錄此時(shí)所吸附的VP-16自微乳的量作為該吸附材料的最大吸附量。

由圖2可見，水不溶性吸附材料微粉硅膠的吸附能力明顯強(qiáng)于其他水溶性材料，達(dá)3.08 g·g-1，從后期開發(fā)方面考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇微晶纖維素作為固體吸附材料。

圖2 不同固體材料對(duì)液態(tài)自微乳制劑的飽和吸附量（n=5）

2.1.5 VP-16固體自微乳制劑的制備工藝 按表2所示，精密稱取處方量的油相、表面活性劑和助表面活性劑置于燒杯中，渦旋使混合均勻成淡黃色透明的空白自微乳。精密稱取處方量的VP-16原料藥置于上述空白自微乳中，渦旋使藥物均勻分散，并于70℃水浴中加熱使藥物溶解，待完全溶解后取出，于室溫下放置，即成VP-16自微乳。加入適量水于上述VP-16自微乳中，邊加邊攪拌，至形成一種粘度較高的乳劑。稱取處方量的固體吸附材料，以上述高粘度乳劑作為粘合劑制軟材，所得軟材擠壓過18目篩制顆粒，并于50℃烘箱中干燥至恒重，經(jīng)20目篩整粒，收集。

2.1.6 VP-16固體自微乳制劑的溶出度考察 按《中國藥典》2010年版溶出度測(cè)定第二法進(jìn)行。溶出介質(zhì):恒溫蒸餾水 900 mL；水浴溫度:（37±0.5）℃；轉(zhuǎn)速:50 r·min-1。投藥量為含有50 mg VP-16的固體自微乳制劑和市售制劑依托泊苷軟膠囊 （1顆，50 mg）， 分別于 2、5、10、15、20、30、45、60 min 取樣 5 mL，并同時(shí)補(bǔ)充同溫度的新鮮溶出介質(zhì)5 mL，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液20μL經(jīng)HPLC法測(cè)定，并計(jì)算累積溶出百分率。

由圖3溶出曲線可知，與市售制劑依托泊苷軟膠囊相比，自微乳制劑均可以提高VP-16的溶出速度和程度，使其在45 min之內(nèi)達(dá)到溶出度95%以上。

圖3 VP-16固體自乳化制劑的體外溶出曲線（n=3）

2.2 VP-16血漿樣品分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長:254 nm；流動(dòng)相:甲醇-醋酸鹽緩沖液（60∶40）；流速:1 mL·min-1；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:20μL。

2.2.2 大鼠血漿樣品處理方法 精密移取100μL血漿，加入氯仿 1 mL，渦旋 5 min，4000 r·min-1離心10 min，取下層有機(jī)相，45℃空氣吹干，加入 100μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋 10 min，4000 r·min-1離心 10 min，取上清液進(jìn)樣。

2.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法學(xué)的驗(yàn)證 取VP-16儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為50、100、500、1000、5000、10000、25000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取具塞離心管7只，精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，45℃空氣吹干，加入100μL空白血漿，渦旋5 min，按“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下處理進(jìn)樣，將所得峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取VP-16標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用大鼠空白血漿配制成低、中、高三個(gè)濃度（50、1000、25000 ng·mL-1）的樣品，按“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下處理進(jìn)樣，考察方法學(xué)的回收率與精密度。

實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=5.886×104C-6.682×103，r=0.9999（n=7），表明在 50～25000 ng·mL-1質(zhì)量濃度（C）范圍內(nèi)，依托泊苷的質(zhì)量濃度與峰面積（A）線性關(guān)系良好。同時(shí)，平均提取回收率在75%～85%，而方法回收率為93%～97%，日內(nèi)和日間精密度（RSD）均小于5%，因而該方法符合生物樣品的分析要求。

2.3 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取雄性Sprague-Dawley大鼠18只，隨機(jī)分為3組，按照20 mg·kg-1[1]分別灌服給予VP-16固體自微乳制劑、市售制劑依托泊苷軟膠囊和原料藥混懸液。 分別于 0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h大鼠眼眶后靜脈叢取血約400μL，置于肝素化離心管中，4000 r·min-1離心 10 min，分離血漿，置于-20℃冰箱保存。血漿樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，測(cè)定血藥濃度。

由圖4血藥濃度-時(shí)間曲線可見，自制固體自微乳制劑40 min后血藥濃度可達(dá)峰值，比原料藥吸收更迅速，和市售制劑幾乎同時(shí)起效。由表3藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果可以得出，VP-16固體自乳化制劑的半衰期和MRT較原料藥的長，而較市售軟膠囊的短。比較AUC發(fā)現(xiàn)，VP-16制成固體自微乳化制劑后AUC與原料藥相比有了顯著的提高，相對(duì)生物利用度為148%；而與市售制劑相比，其相對(duì)生物利用度為116%。

圖4 VP-16原料和各制劑經(jīng)大鼠灌胃給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線

表3 VP-16原料及各制劑經(jīng)大鼠灌胃給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）

3 討 論

在偽三元相圖制備過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系剛開始用蒸餾水滴定時(shí)，由于含水量很少，均可以形成油包水的乳劑或微乳，表現(xiàn)為一種透明的或略帶乳光的油狀液體。一些油相含量較高，且Km較小的體系繼續(xù)加水變?yōu)闇啙岬娜榘咨后w，表明未形成微乳；而油相含量較低，且Km較大的體系繼續(xù)加水后會(huì)變成有藍(lán)色乳光的透明或半透明的微乳液，從外觀上判斷可認(rèn)為形成了水包油型的微乳。

由于微粉硅膠作為固體吸附劑時(shí)在制粒過程中成形性較差，不利于后期的加工，而微晶纖維素作為一種高度多孔性顆?；蚍勰旧砭哂辛己玫奈叫?，再加上分子結(jié)構(gòu)中具有眾多的親水性羥基，使得其吸附自微乳后所得的粉末對(duì)于藥物的溶出幾乎沒有影響[4]。另外，微晶纖維素是文獻(xiàn)報(bào)道[5]使用最多的輔料，具有良好的可塑性和成球性，便于后期開發(fā)應(yīng)用，綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而選擇微晶纖維素作為固體吸附材料制備自微乳化顆粒。

在體外溶出度實(shí)驗(yàn)中，兩種制劑在水中溶出行為產(chǎn)生差別的原因可能是:VP-16市售軟膠囊內(nèi)容物加水稀釋后析出沉淀[5]，從而導(dǎo)致溶出后期累積溶出百分?jǐn)?shù)有所下降。

研究表明，采用微乳化技術(shù)可提高難溶性藥物的口服生物利用度[6-8]，其機(jī)理主要有以下幾個(gè)方面:利用油、表面活性劑等成分增加藥物的溶解度并改善溶出度；自發(fā)形成的細(xì)小乳滴具有巨大的比表面積，增加了藥物在胃腸道上皮細(xì)胞的滲透性；微乳乳滴較低的表面張力和較強(qiáng)的親水性使其易于通過腸腔黏膜上側(cè)的水化層，使藥物可以直接和胃腸道上皮細(xì)胞接觸，促進(jìn)藥物的吸收；常用的非離子表面活性劑可以抑制一些外排蛋白對(duì)藥物的外排，進(jìn)而增加吸收；微乳中的脂質(zhì)在胰酶和膽汁的作用下發(fā)生脂解，形成粒徑更小的微乳乳滴和膽鹽膠束，可以進(jìn)一步增加藥物的溶解度和促進(jìn)藥物的跨膜吸收轉(zhuǎn)運(yùn)；處方中的脂質(zhì)成分可以經(jīng)腸道淋巴管吸收，減小藥物的首過效應(yīng)，提高生物利用度。

4 結(jié) 論

本文制備了VP-16固體自微乳制劑，其溶出度在45 min時(shí)達(dá)到95%以上。大鼠灌胃給藥后其生物利用度較原料藥和市售軟膠囊均有所提高。同時(shí)，從溶出度實(shí)驗(yàn)中可見，市售軟膠囊在溶出過程中析出大量沉淀，而VP-16固體自微乳制劑則可在釋放介質(zhì)中穩(wěn)定存在，由此推測(cè)市售軟膠囊制劑在口服進(jìn)入機(jī)體后，也可能析出大量沉淀，藥物富集于胃腸道中，致使生物利用度較低，因而容易引起胃腸道副反應(yīng)。依托泊苷固體自微乳制劑經(jīng)口服后，在胃腸蠕動(dòng)和體液環(huán)境下自發(fā)形成微乳，并迅速分散到整個(gè)胃腸道，吸收面積加大，促進(jìn)了其吸收進(jìn)入體循環(huán)的速度，進(jìn)而可能提高了其生物利用度，并降低對(duì)胃腸道的副作用。

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