郁俊德，葉紅波，陳文瑛，芮建中**

1蘇州市木瀆人民醫(yī)院藥劑科，蘇州 215101；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，南京 210002；3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣州 510120

他克莫司是一種免疫抑制劑，主要用于肝臟、腎臟等器官移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)和一些自身免疫性疾病的治療。由于其個體差異大，有效的治療藥物濃度范圍窄，臨床常采取藥物監(jiān)測的辦法來保證其安全性和有效性。目前國內(nèi)有針對特定的用藥人群進(jìn)行的群體藥代動力學(xué)分析，如仇向華[1]對肝移植患者、張關(guān)敏[2]對腎移植患者的群體藥代動力學(xué)分析等，但是從未系統(tǒng)地分析過不同人群的參數(shù)差異。本文收集兩類用藥人群的全量采樣數(shù)據(jù)，運(yùn)用非線性混合效應(yīng)模型（NONMEM）進(jìn)行群體分析，探索人群間的藥代動力學(xué)參數(shù)差異。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

收集分別來自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、天津市第一醫(yī)院的他克莫司全量采樣濃度數(shù)據(jù)。其中蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的受試人群是健康志愿者，采用單劑量口服給藥的方式連續(xù)測定藥后0～72 h藥物濃度，使用超高壓液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-MS/MS）分析；天津市第一醫(yī)院的受試人群是肝移植患者，采用常規(guī)免疫抑制劑三聯(lián)療法（他克莫司+霉酚酸酯+激素），口服他克莫司達(dá)5天以上，測定穩(wěn)態(tài)時谷濃度和給藥后0～12 h藥物濃度，使用微粒子酶聯(lián)免疫分析法（MEIA）分析。

記錄受試人群的性別、年齡、體重，考察人群差異對他克莫司藥代動力學(xué)參數(shù)的影響。人群間差異記為CENT，其中健康受試者為0、肝臟移植患者為1。分析儀器記為INST，為分類變量，其中UPLCMS/MS為 1、MEIA 為 2。

1.2 數(shù)據(jù)分析工具

NONMEM軟件包（double precision,Version VI,Level 2.2）；G77 Fortran；Origin?8.0；PsN 3.1.0 （Uppsala University,Uppsala,Sweden)；Perl （ActiveState Software Inc.）；PDx3.1 試用版（Icon developmental solutions,Hanover,MD,USA）；操作系統(tǒng) windows XP。

1.3 模型建立

1.3.1 基礎(chǔ)模型 采用二房室血管外給藥方式描述他克莫司的藥代動力學(xué)過程，NONMEM分析時調(diào)用PREDPP的advan4、trans4模塊，即吸收速度常數(shù)（Ka）、中央室清除率（CL）、中央室分布容積（V2）、室間清除率（Q）、外周室分布容積（V3）等參數(shù)。由于多次給藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，吸收遲滯現(xiàn)象消失，所以僅在單劑量口服給藥過程中引入吸收遲滯時間參數(shù)（ALAG）。個體間變異采用指數(shù)模型[3]，ω為個體間變異的標(biāo)準(zhǔn)差。殘差變異采用常系數(shù)模型[3]（CCV），根據(jù)NONMEM說明書[4-5]，將INST作為殘差變異考察，所以設(shè)定 ε1、ε2分別是INST等于 1、2時的殘差變異（見式1），其中，Y是實(shí)際觀察濃度，F(xiàn)是模型預(yù)測濃度。σ1、σ2即為殘差變異的標(biāo)準(zhǔn)差。算法選擇一級條件算法（FOCEI）。

1.3.2 協(xié)變量模型 NONMEM依據(jù)最小擴(kuò)展二乘法（ELS）與最大似然法（ML）一致，即目標(biāo)函數(shù)最小值OFVmin等于最大似然值-2logLmax進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，目標(biāo)函數(shù)下降值 （drop of objective function value,DOFV）服從F分布，近似χ2分布。NONMEM可以將個體間變異中的一部分以協(xié)變量函數(shù)關(guān)系的方式來定量解釋，通過定顯著水平α來決定是否引入?yún)f(xié)變量。使用PsN[6]的協(xié)變量模型程序進(jìn)行協(xié)變量的有序遞加和向后剔除。PsN按照協(xié)變量的性質(zhì)選擇指示標(biāo)量模型和乘方模型，逐一考察每個協(xié)變量對參數(shù)的影響，然后在大于DOFV的協(xié)變量中選擇目標(biāo)函數(shù)值下降最大的，作為下一步遞加的模型。但是由于沒有考慮到參數(shù)個體間變異和殘差變異的優(yōu)化趨勢，所以在每次遞加完成后對模型進(jìn)行篩選，選擇目標(biāo)函數(shù)值大于DOFV且個體間變異和殘差變異都最大優(yōu)化的模型。

有序遞加 定顯著水平α=0.01，通過χ2分布表查知，即當(dāng)每引入一個協(xié)變量（自由度df=1）時，如DOFV＞6.64，那么保留該效應(yīng)。同時注意每引入一個協(xié)變量，個體間變異和殘差變異應(yīng)當(dāng)減小，或至少不能明顯增大。有序遞加法（stepwise inclusion）經(jīng)過篩選后保留的協(xié)變量按照DOFV從大到小的順序依次加入到基礎(chǔ)模型中。定顯著性水平為α=0.01，df=1，如DOFV＞6.64，則引入模型，依次將篩選出來的協(xié)變量加入到模型中去，建立全量回歸模型（full regression model,FRM）。

向后剔除 向后剔除法（backward elimination）通過將全量回歸模型中的任一協(xié)變量剔除進(jìn)行檢驗(yàn)。定顯著性水平為α=0.005，自由度df=1，如果DOFV＞7.88，則該協(xié)變量對參數(shù)有顯著性影響，應(yīng)保留該協(xié)變量在模型中，否則將其剔除。所有保留的協(xié)變量組成最終模型（final regression model）。

1.3.3 擬合優(yōu)度評價 為了估算模型的預(yù)測精準(zhǔn)性，模型擬合優(yōu)度用群體的權(quán)重殘差（WR）的平均值 （MWR）和絕對權(quán)重殘差 （AWR）的平均值（MAWR），以及個體的權(quán)重殘差 （IWR）的平均值（MIWR）和絕對權(quán)重殘差（AIWR）的平均值（MAIWR）來評估。公式如下:

其中DV表示觀察值，PRED、IPRED分別是模型預(yù)測值和Bayesian反饋后的個體預(yù)測值。模型如果能很好的預(yù)測DV，PRED、IPRED將接近DV，那么WR、MWR、AWR、MAWR就越接近0， 則擬合優(yōu)度就會越好。做DV-PRED、DV-IPRED散點(diǎn)圖可以直觀的反映出模型的擬合優(yōu)度。

1.4 模型驗(yàn)證

為評價最終模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，采用自舉法（bootstrap）對模型進(jìn)行驗(yàn)證和評價。自舉法是一種內(nèi)部驗(yàn)證方法，通過驗(yàn)證最終模型各參數(shù)的穩(wěn)定性，來表示最終模型的穩(wěn)定性。本文使用PsN 3.1.0[6]進(jìn)行自舉驗(yàn)證，自舉法驗(yàn)證的結(jié)果以自舉500次各參數(shù)的95%CI、中位數(shù)與最終模型參數(shù)的偏差（%）來表示。

2 結(jié) 果

2.1 基本資料

我們共收集了65例個體他克莫司藥物濃度數(shù)據(jù)，其中43例為健康受試者，22例為肝臟移植患者術(shù)后服用他克莫司的數(shù)據(jù)。蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的數(shù)據(jù)采樣點(diǎn)是服藥前0 h和服藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、10、12、16、24、36、48、72 h，天津市第一醫(yī)院的數(shù)據(jù)采樣點(diǎn)是達(dá)穩(wěn)態(tài)后服藥前0 h和服藥后 0.33、0.66、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h， 藥物濃度均值為 9.87μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)差是 9.89μg·L-1，范圍是0.10～70.04μg·mL-1，共計(jì) 844 個數(shù)據(jù)點(diǎn)，年齡范圍是19～72周歲，體重范圍是 37～87 kg，女性和男性的比例是 5∶60。 見表 1。

表1 他克莫司（FK506）的群體數(shù)據(jù)集（65例，844個血樣）

2.2 群體藥代動力學(xué)模型（Pop-PK）

2.2.1 基礎(chǔ)模型 基礎(chǔ)模型為二房室模型，結(jié)果見表2。個體間變異最大的參數(shù)為V2（119%），最小為Q（62.8%），兩種分析儀器之間的殘差誤差也有差異。由表2可見，UPLC-MS/MS的殘差變異為8.47%，MEIA的殘差變異為39.10%。這表明UPLCMS/MS的精密度高?；A(chǔ)模型的擬合優(yōu)度為MWR（0.68%）、MAWR（1.09%）、MIWR（-0.065%）、MAIWR（0.16%）。

表2 群體藥代動力學(xué)基礎(chǔ)模型

2.2.2 最終模型 有序遞加法得到全量回歸模型，再經(jīng)過向后剔除法得到最終模型，結(jié)果見表3:向后剔除過程中的DOFV為16.93，表明CENT對V2和Q統(tǒng)計(jì)學(xué)均有顯著性意義。

表3 協(xié)變量模型建立的結(jié)果

最終模型參數(shù)表達(dá)式見式6:

GEND、AGE、BW等協(xié)變量對參數(shù)沒有顯著性影響。人群間差異對參數(shù)V2和Q有顯著性影響。最終模型表明肝臟移植患者的V2和Q比健康受試者的高出2.34倍和1.69倍。

根據(jù)最終模型 Ka、CL、V2、Q、V3的 ω2（見表 4），得個體間變異分別為30.2%、71.8%、131%、42.9%、59.7%。 與基礎(chǔ)模型比較，Ka、CL、Q、V3個體間變異分別降低了 38.6%、1.4%、19.9%、23.4%，但 V2的個體間變異略增。 σ12、σ22分別是 0.00714、0.118，所以UPLC-MS/MS、MEIA的殘差變異系數(shù)分別是8.45%、34.4%。

2.3 模型評價及驗(yàn)證

擬合優(yōu)度情況為:MWR、MAWR、MIWR 從 0.68、1.09、0.065 下降為 0.52、0.97、0.062，MAIWR 從 0.157略增至0.166。最終模型的DV-PRED、DV-IPRED散點(diǎn)圖見圖1和圖2，決定系數(shù)（R2）分別是0.42和0.82。

圖1 最終模型擬合的他克莫司群體估算值（PRED）與濃度觀察值（DV）的相關(guān)趨勢圖

自舉500次，成功371次。各參數(shù)自舉的95%CI均包含最終模型值，表明模型參數(shù)穩(wěn)定 （見表4），其中 Ka、ALAG、CL、V2、Q、V3分別指的是最終模型參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值，V2-CENT表示CENT對V2的影響參數(shù)，ω2（Ka）表示Ka的個體間變異所服從正態(tài)分布的方差，其余依次類推。

表4 最終模型擬合的群體參數(shù)及自舉驗(yàn)證結(jié)果（500次自舉運(yùn)行，成功371次）

圖2 最終模型擬合的他克莫司個體估算值（IPRED）與濃度觀察值（DV）的相關(guān)趨勢圖

3 討 論

本文收集的數(shù)據(jù)中女性只占到總數(shù)的8%，因此雖然沒有發(fā)現(xiàn)參數(shù)的性別間差異，但是這有待更加均衡的群體分析證實(shí)。本文收集的年齡、體重因素，經(jīng)過群體分析，證實(shí)對參數(shù)沒有影響，這與國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道[2,7]一致。

雖然中央室表觀清除率（CL）在2種人群間沒有發(fā)現(xiàn)差異，但是外周室表觀清除率（Q）卻存在差異。肝臟移植患者的（Q）比健康受試者高出1.69倍。

有文獻(xiàn)[8]報道健康受試者的中央室分布容積（V2）顯著低于移植患者[9]，這與本研究的結(jié)論一致。本文發(fā)現(xiàn)肝臟移植患者的V2比健康受試者高出2.34倍。推測的原因是健康受試者的肌體組織正常，紅細(xì)胞比積高于移植患者，而他克莫司又屬于脂溶性藥物，因此當(dāng)血液中紅細(xì)胞的量增加時，他克莫司主要與紅細(xì)胞結(jié)合，很難再分布到周圍組織中去，從而使得V2比患者的要小。

兩種分析測試方法在納入殘差變異分析后，結(jié)果顯示它們之間存在精密度差異，UPLC-MS/MS精密度好。

目前他克莫司主要用于肝臟移植、腎臟移植和造血干細(xì)胞移植患者，本研究提示，將這3類患者服用他克莫司的數(shù)據(jù)進(jìn)行群體藥代動力學(xué)分析，將能客觀地比較和發(fā)現(xiàn)它們之間的群體參數(shù)差異。

有文獻(xiàn)[3,10,11]報道他克莫司的體內(nèi)代謝差異與CYP3A5等基因型有關(guān)，目前國內(nèi)已有學(xué)者開始研究，其與用藥人群間的參數(shù)差異的相互作用有待進(jìn)一步研究。

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