何鳳娟， 肖衍宇， 操 鋒， 孫敏捷， 平其能

(中國藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)為一種新型抗癲癇藥物，具有較強的抗癲癇活性，且對部分性和全身性發(fā)作均有效;本品極易溶于水，口服后可被迅速吸收，生物利用度接近100%，血漿蛋白結(jié)合率小于10%，平均半衰期約為7 h［1］。目前，國內(nèi)市售LEV制劑僅1種，即每次500～1500 mg，每日需給藥2次的口服片劑，該片劑口服后，因藥物釋放迅速，血藥濃度較高，可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，如嗜睡、疲勞、協(xié)調(diào)困難和行為失常等。為了在確保LEV療效的前提下降低其不良反應(yīng)發(fā)生率，比利時優(yōu)時比(UCB)制藥公司研制了每日只需給藥1次的LEV緩釋片劑(商品名:Keppra XRTM)，該制劑已于2009年獲美國FDA批準上市，但目前并未在國內(nèi)上市。筆者所在課題組參考相關(guān)文獻，以羥丙甲基纖維素(HPMC)為骨架材料制備了與 Keppra XRTM具有相似釋藥行為的LEV緩釋片，其制備工藝簡單、質(zhì)量可控，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);RS-8型智能溶出試驗儀(天津大學(xué)無線電廠);TDP型單沖壓片機(江蘇省泰州市金泰制藥機械有限公司);YPD-300D型片劑硬度儀(上海黃海藥檢儀器廠);BY300A型小型包衣鍋(上海黃海藥檢儀器廠)。

左乙拉西坦原料藥(批號:091001，純度:99.3%，北京世紀邁勁生物科技有限公司);左乙拉西坦緩釋片(商品名:Keppra XRTM，批號:57577，規(guī)格:500 mg，比利時UCB制藥公司);HPMC(型號:Methocel K4M、Methocel K15M 和 Methocel K100M，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司);聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30，美國國際特品公司)，歐巴代(Opadry，型號:OY-C-7000A，上海卡樂康包衣技術(shù)有限公司);甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司);雙蒸水為實驗室自制。

2 方法

2.1 分析方法的建立和考察

2.1.1 色譜條件 固定相為Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇－水(0.3 mol·L－1KH2PO4，以 H3PO4調(diào)節(jié) pH 值至3.0)(25∶75)，流速為1 mL·min－1;柱溫為40 ℃;檢測波長為 210 nm;進樣量為 20 μL［2-3］。

2.1.2 標準曲線的繪制 取LEV原料藥適量，精密稱定，溶解于pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中配制成質(zhì)量體積濃度為100 mg·L－1的貯備液，再以 pH 6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋制得質(zhì)量體積濃度分別為8、10、15、20、30、40 和 60 mg·L－1的系列標準溶液，進樣，以色譜峰面積(Y)對質(zhì)量體積濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程:Y=2943.7X+1417.5(r=0.9999)?？梢?，LEV 在8 ～60 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 分析方法專屬性 取LEV原料藥適量，精密稱定，溶解于流動相中配制成濃度為50 mg·L－1的供試溶液。按優(yōu)化后的處方比例稱取HPMC K15M、PVP K30和硬脂酸鎂，過80目篩混勻，取混勻后的輔料25 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加流動相適量，超聲波處理30 min，使HPMC充分溶解，然后以流動相定容，最后以孔徑為0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液0.5 mL置10 mL量瓶中，以流動相定容，即得。取上述制備的LEV供試液和輔料供試液進樣，考察在“2.1.1”項下的色譜條件下輔料對LEV測定的干擾情況。結(jié)果顯示，輔料對LEV測定無干擾(見圖1)，表明該方法專屬性良好。

圖1 左乙拉西坦原料藥和輔料的HPLC圖譜Figure 1 The HPLC chromatogram of LEV and excipients

2.1.4 精密度 取LEV原料藥10 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入pH 6.0磷酸鹽緩沖液適量，超聲波處理3 min，以pH 6.0磷酸鹽緩沖液定容，所得溶液過0.45 μm濾膜后，分別移取1、3和6 mL續(xù)濾液至10 mL量瓶中，以pH 6.0磷酸鹽緩沖液定容，配制成3種濃度的LEV供試液，分別在1天內(nèi)連續(xù)進樣5次，考察日內(nèi)精密度;每天進樣1次，連續(xù)5天，考察日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD分別為0.48%、0.60%和0.46%，日間精密度RSD分別為2.52%、3.12%和2.96%，均小于5%，表明該方法精密度良好。

2.1.5 加樣回收率 按優(yōu)化后的處方比例稱取HPMC K15M、PVP K30和硬脂酸鎂，過80目篩(篩孔徑0.18 mm)混勻，取混勻后的輔料25 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，平行9份，然后按處方量的80%、100%和120%加入LEV原料藥，每個藥物量平行3份，再加入pH 6.0磷酸鹽緩沖液至刻度，待HPMC充分溶解后過孔徑為0.45 μm的濾膜，取續(xù)濾液1 mL稀釋至10 mL，配制成3種濃度的供試液，進樣，按“2.1.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，上述低、中、高濃度供試液回收率分別為(99.61±0.01)%、(98.61±0.01)%和(99.02±0.01)%，RSD分別為0.98%、0.42%和0.97%，表明該分析方法準確度較高，符合方法學(xué)要求。

2.2 體外釋放度的測定

參考市售制劑選擇的釋放條件［4］，采用《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅩC中的轉(zhuǎn)籃法［5］，溶出介質(zhì)為pH 6.0磷酸鹽緩沖液900 mL，溫度為(37 ±0.5)℃，轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速為 100 r·min－1，分別于0.5、1、2、4、6、8、10 和 12 h 時取樣 5 mL，同時向溶出杯中補充同溫等量溶出介質(zhì)。每次所取樣品經(jīng)濾膜(孔徑0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液1 mL置于10 mL量瓶中，定容后進樣，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算LEV的累積釋放百分率。

2.3 左乙拉西坦緩釋片制備工藝的優(yōu)化

將LEV原料藥和HPMC過80目篩混勻，加入5%PVP K30乙醇溶液制成軟材，過20目篩(篩孔徑0.83 mm)制粒，60℃下干燥后再以18目篩(篩孔徑0.88 mm)整粒，然后加入適量硬脂酸鎂混合均勻，使用11#(19 mm×7.5 mm)深凹橢圓形沖模進行壓制，即得規(guī)格為500 mg的素片。稱取一定量的歐巴代，加入85%的乙醇溶液，使歐巴代質(zhì)量體積濃度為70 g·L－1，室溫攪拌40 min后采用小型包衣鍋進行包衣，包衣溫度40℃，包衣增重為片芯質(zhì)量的3%，包衣結(jié)束后在包衣鍋內(nèi)40℃下固化30 min。按“2.2”項下方法對在不同 HPMC型號、LEV與HPMC質(zhì)量比、制備方法和片劑硬度條件下所制片劑的LEV累積釋放百分率進行測定。采用相似因子法對自制緩釋片與市售緩釋制劑的體外釋藥行為進行比較。相似因子(f2)計算公式如下:

其中，Rt為參比樣品在t時間的釋放度，Tt為供試品在t時間的釋放度，n為取樣點數(shù)。

2.4 左乙拉西坦緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中釋放行為的考察

對優(yōu)化后工藝所得的LEV緩釋片在pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸－醋酸鈉緩沖液、pH 6.0磷酸鹽緩沖液與雙蒸水中的釋藥行為進行考察。

2.5 左乙拉西坦緩釋片穩(wěn)定性的初步考察

按照《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩC中的原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則［6］，對按優(yōu)化后處方自制的一批LEV緩釋片進行穩(wěn)定性考察:將自制LEV緩釋片置于潔凈的表面皿中，分別于(90±5)%、(75±5)%濕度，60℃高溫，以及(4500±500)Lx強光照射條件下放置10 d，于第5和10 d取樣，考察片劑的外觀性狀、增重情況、藥物含量及不同時間點的累積釋放百分率。

3 結(jié)果

3.1 左乙拉西坦緩釋片制備工藝的單因素考察結(jié)果

3.1.1 市售左乙拉西坦緩釋片釋放曲線的繪制體外釋放度測定結(jié)果顯示，市售LEV緩釋片Keppra XRTM中LEV在0.5、2和8 h時的累積釋放百分率分別為(19.56±0.07)%、(47.52±0.28)%和(94.34±1.65)%，其釋放曲線如圖2所示。

圖2 Keppra XRTM中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的釋放曲線Figure 2 The LEV release curve of Keppra XRTMin pH 6.0 phosphate buffer solution

3.1.2 羥丙甲基纖維素型號的選擇 固定LEV與HPMC的質(zhì)量比為3∶1，分別選用HPMC K 4M、K 15M和K 100M這3種不同黏度的HPMC為骨架材料，按“2.3”項下方法壓片，制得片劑 A、B、C，并對片劑中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率進行測定。結(jié)果顯示，選用K 4M和K 15M為骨架材料所制備的緩釋片釋藥速率較快，而用黏度較高的K 100M制備的緩釋片釋藥速率最慢(見圖3)。片劑A、B、C 與市售制劑的 f2分別為 68.64、81.08和49.75，表明用K 15M制備的緩釋片釋藥行為與市售制劑最為接近，故在后續(xù)研究中選擇K 15M作為緩釋骨架材料。

圖3 用不同型號HPMC所制緩釋片的藥物釋放曲線Figure 3 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared with different types of HPMC

3.1.3 左乙拉西坦與羥丙甲基纖維素比例的確定 選擇K15M作為骨架材料，對在不同LEVK15M 質(zhì)量比(2∶1、3∶1和 4∶1)條件下制備的緩釋片A、B、C中LEV體外釋放度及f2進行考察。結(jié)果顯示，隨著K15M比例的增加，LEV釋藥速率逐漸降低(見圖4)。緩釋片 A、B、C與 Keppra XRTM的 f2分別為 66.33、81.07、63.93，其中緩釋片 B的釋藥行為與Keppra XRTM最為接近，故確定LEVK15M質(zhì)量比為3∶1。

圖4 不同LEV-HPMC質(zhì)量比下制備的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 4 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared under different LEV-HPMC ratios

3.1.4 制備方法的選擇 確定LEV與K15M質(zhì)量比為3∶1，分別以“2.3”項下濕法制粒壓片工藝(工藝1)和粉末直接壓片工藝(工藝2，即稱取與濕法制粒工藝中相同質(zhì)量的HPMC K 15M、PVPK30和硬質(zhì)酸鎂，過80目篩，以等量遞增法混勻，壓片)進行壓片，硬度均為17 kg，并對片劑中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率進行測定。結(jié)果顯示，上述2種制備工藝所得緩釋片的藥物釋放曲線無顯著性差異(見圖5)。工藝1和工藝2所制得的緩釋片與 Keppra XRTM的 f2分別為70.68和82.44，考慮到國內(nèi)廠家多以濕法制粒為主，最終選擇濕法制粒工藝。

圖5 不同方法制備的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 5 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared by different methods

3.1.5 片劑硬度的選擇 將LEV與K15M按質(zhì)量比為3∶1，以濕法制粒法制得的同一批顆粒制成硬度分別為13～15、16～17和18～19 kg的緩釋片 A、B、C，并測定LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率。結(jié)果顯示，片劑硬度范圍為13～19 kg時，硬度對片劑LEV釋放行為無顯著影響(見圖6)。

圖6 不同硬度的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 6 The release curves of LEV sustained-release tablets with different hardness

上述3種硬度的LEV緩釋片與Keppra XRTM的f2分別為77.29、76.28和76.67。為防止包衣過程中片劑硬度過小而導(dǎo)致的掉粉和硬度過大造成的壓片機磨損，本研究確定LEV緩釋片硬度為16～17 kg。

3.2 左乙拉西坦緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放行為

實驗顯示，釋放介質(zhì)pH值對LEV的釋放行為無顯著影響(見圖7)。此外，不同pH下的LEV釋放曲線與Keppra XRTM的f2均在70以上。為方便起見，在后續(xù)穩(wěn)定性研究中選用雙蒸水作為釋放介質(zhì)。

圖7 LEV緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放曲線Figure 7 The release curves of LEV sustained-release tablets in dissolution medium of different pH values

3.3 左乙拉西坦緩釋片穩(wěn)定性考察結(jié)果

LEV緩釋片穩(wěn)定性研究結(jié)果如表1所示。經(jīng)不同條件處理的緩釋片LEV含量及釋放度等各項指標均無明顯改變;需注意的是緩釋片在(90±5)%的高濕度條件下易吸潮，表面包衣層起皺，提示該制劑在貯藏過程中需注意防潮。

表1 LEV緩釋片穩(wěn)定性研究結(jié)果Table 1 The results of stability study on LEV sustained-release tablets

4 討論

1)LEV具有一定的刺激性氣味且味微苦，故研究中對緩釋片進行包衣，以掩蓋藥物的不良氣味，提高患者服藥的依從性。

2)由于LEV給藥劑量較大，為確?；颊哂盟幍囊缽男裕貞?yīng)盡可能小;而若要達到理想的緩釋效果，緩釋材料又不能太少，因此綜合考慮片重和藥物釋放效果，在HPMC型號的篩選試驗中，暫定LEV與HPMC的質(zhì)量比為3∶1。

3)相似因子法可直接對釋藥數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，不需對各種釋藥曲線進行擬合，現(xiàn)已被FDA推薦應(yīng)用，故本研究采用該法比較自制緩釋片與市售緩釋片的體外釋藥行為。一般來說，f2越接近于100，表明2種制劑的體外釋藥行為越相近;f2值在50～100間時，可認為2種制劑體外釋藥行為無顯著差異［7］。

4)水溶性藥物主要通過擴散作用從HPMC骨架片中釋放，此外也會隨著HPMC水凝膠的溶蝕而釋放［8-9］。對于該自制LEV緩釋片劑，由于LEV屬于高水溶性藥物，釋藥迅速，因此片劑中藥物釋放速度主要取決于所用HPMC的自身性質(zhì)?；诖?，筆者著重對HPMC的型號和用量進行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，選用高黏度的K100M為骨架材料時，LEV釋放速率明顯低于另外2種型號的HPMC，原因是HPMC黏度越大，形成的凝膠層強度越大，骨架溶蝕速率越慢;LEV釋放速率隨著HPMC用量的增加而減緩，這是因為HPMC用量增加時，其形成的水化凝膠層的厚度也會增大，從而影響藥物的釋放［10-11］;本實驗中片劑硬度的增加并不會減緩LEV的釋放速率，筆者認為，該自制緩釋片主要通過HPMC水化凝膠層釋放藥物，影響其釋放速率的關(guān)鍵因素應(yīng)為水化后的凝膠骨架片的曲率和孔隙率［9，12］，而硬度只能影響 HPMC 骨架片本身的密度和骨架未水化時的曲率和孔隙率，因此實驗中不同硬度的緩釋片其藥物釋放行為無明顯差異。

5)經(jīng)工藝優(yōu)化，本研究最終確定了LEV緩釋片的最佳制備工藝:以K15M為緩釋骨架材料，LEV與K15M質(zhì)量比為3∶1，通過濕法制粒工藝壓片，片劑硬度為16～17 kg。該制備工藝簡單易行，穩(wěn)定性好，易于控制，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求。

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［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版:二部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅪⅩC.

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