張菁華

(菏澤醫(yī)學?？茖W校,山東 菏澤 274000)

近年來,我國肺癌的發(fā)病率及病死率已躍居惡性腫瘤首位。在癌癥的診治及預后中,iNOS受到廣泛關注。近期研究顯示,iNOS因促進新生血管生成而有助于血管依賴的實體瘤的生長,其在肺癌中表達的研究也炙手可熱。我們應用免疫組織化學法檢測16例肺癌組織標本中iNOS的表達,探討iNOS在肺癌中的表達意義及與肺癌臨床病理特征的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本組資料選取菏澤市立醫(yī)院病理科2010年6月～2010年12月手術切除并經(jīng)病理確診的肺癌患者的石蠟標本16例,其中鱗癌8例,腺癌8例,所有病例均有完整的臨床資料。患者術前均未行放療、化療及生物免疫治療,手術中取肺癌組織及淋巴結(jié)、正常肺組織[所切除肺距離病灶最遠處(＞3 cm)的正常組織]。

1.2 診斷標準

依據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的標準進行分類和TNM分期。

1.3 主要試劑

美國Santa Cruz公司制造生產(chǎn)的兔抗人iNOS多克隆抗體,美國Zymed公司生產(chǎn)制造的SP-streptavidin/per-oxidase kit,Sigma公司生產(chǎn)的考馬斯亮藍 G-250染料、BSA、二巰基乙醇,德國羅氏公司生產(chǎn)的PVDF膜以及Pierce公司生產(chǎn)的ECL顯色液。

1.4 免疫組化染色

采用鏈霉菌抗生物素過氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,S-P)免疫組化法,按S-P試劑盒操作說明進行操作。腫瘤組織切除后,立即取標本,放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩吮局糜谥行愿栺R林中固定,石蠟包埋,4 μ m厚度連續(xù)切片后供常規(guī)HE染色及SP法免疫組織化學染色。具體步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,PBS洗兩次各5 min,3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶,室溫靜置10 min,PBS洗兩次各5 min,高壓鍋修復抗原,PBS洗兩次各5 min,滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,滴加 iNOS一抗,室溫靜置1 h,PBS洗 3次每次 2 min,滴加生物素標記二抗,室溫靜置1 h,PBC洗3次每次5 min,DAB顯色試劑盒顯色10 min,PBS沖洗10 min,蘇木素復染2 min、鹽酸酒精分化,自來水沖洗10 min,脫水、透明、封片、鏡檢。對照染色,以陽性對照片作為陽性對照;以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.5 免疫組化結(jié)果判定及計數(shù)方法

iNOS的陽性表達為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。根據(jù)著色深淺程度及陽性胞數(shù)的多少,對表達程度進行半定量評估分級,分別評為0～3分。即染色強度:陰性對照(0分);染色弱但明顯高于陰性對照(1分);染色清晰(2分);染色強(3分)。陽性細胞數(shù)≤10%為0分;11%-25%為1分;26%-50%為2分;≥51%為3分。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件,采用χ2檢驗,t檢驗,直線相關分析,以P=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

免疫組織化學結(jié)果顯示肺癌組織中iNOS陽性例數(shù)為10例,占總數(shù)的62.5%,其中腺癌和鱗癌陽性例數(shù)分別為6例和4例(75.0%VS 50.0%),在癌旁正常組織中,iNOS的陽性例數(shù)為1,陽性率為6.3%,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00),見表 1。

表1 iNOS在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達Tab.1 Expression of iNOS in lung cancer tissues and adjacent normal tissues

3 討論

惡性腫瘤與iNOS在不正常的生理相關濃度下產(chǎn)生高水平表達有關[1]。iNOS在健康人體組織中不表達或低表達,而通常在炎癥或腫瘤等病理條件下誘生。iNOS為Ca2+非依賴性,在細胞因子及其他細胞毒性物質(zhì)的作用下產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)。NO是大多數(shù)組織中關鍵的第二信使,持續(xù)合適濃度的NO促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,過高濃度的NO則產(chǎn)生抗瘤效應。iNOS誘導合成納摩爾(nmol)水平的NO,較正常生理條件下的 NO濃度約高1 000倍,但卻比引起細胞凋亡的活性低1-2個數(shù)量級,所以iNOS誘導生成的NO在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中主要起促進作用[2]。iNOS誘導生成的NO在NPC中可能起了關健性的作用[3]。

血管增生是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移至關重要的條件[4]。iNOS表達能影響腫瘤血管生成,促進腫瘤生長,因此與腫瘤的惡性程度密切相關[5,6]。近年來研究表明,iNOS活性的增高與腫瘤血管生成有關[4],與本研究得出的肺癌組織中iNOS表達高于癌旁正常組織的結(jié)果一致。

表2 iNOS表達與各臨床病理特征間的關系Tab.2 Correlation of iNOS expression and clinical/pathological characteristics

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌中iNOS的表達與性別和年齡有關。在日常生活中,男性較女性、老年較青壯年更多接觸到煙霧環(huán)境。有研究證明,吸煙肺癌患者的iNOS較不吸煙患者的陽性率高[7]。與本研究得出的男性患者肺癌組織中iNOS的陽性率高于女性的結(jié)果一致。

本次研究結(jié)果提示,iNOS在肺癌細胞中高表達,表明iNOS在一些惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

[1]Hirst D,Robson T.Nitric Oxide in Cancer T herapeutics:Interaction with Cy totoxic Chemotherapy[J].Current Pharmaceutical Design,2010,16(4):411-420.

[2]劉陽云,趙素萍.誘導型一氧化氮合酶在腫瘤組織中的作用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2008,29(5):434-436.

[3]劉陽云,趙素萍,劉庚勛,等.誘導型一氧化氮合酶在指導晚期鼻咽癌治療方案選擇中的價值[J].中國癌癥雜志,2007,17(9):684-688.

[4]Sahin M,Sahin E,Gumuslu S.Cyclooxygenase-2 in Cancer and Angiogenesis[J].Experimental Vascular Biology,2009,60(2):242-253.

[5]顏美榮,李正賢,劉庚勛,等.iNOS、CD34在翼狀胬肉中的表達與血管形成的關系[J].臨床軍醫(yī)雜志,2009,37(5):856-858.

[6]Kanwar JR,Kanwar RK,Burrow H,et al.Recent advances on the roles of NO in cancer and chronic inflammatory disorders[J].Current Medicinal Chemistry,2009,16(19):2373-2394.

[7]Chen GG,Lee TW,Xu H,et al.Increased inducible nitric oxide synthase in lung carcinoma of smokers[J].Cancer,2008,112(2):372-381.