唐斌斌，杜書君，孫德龍，郝保華(.山東陽谷縣人民醫(yī)院，陽谷縣5300；.西北大學生命科學學院，西安市70069)

青風藤味苦、辛，性平，歸肝、脾經，具有祛風濕、通經絡、利小便的功效，主要用于治療風濕痹痛、關節(jié)腫痛、麻痹瘙癢[1]。其主要化學成分是以青藤堿為主的生物堿類，然而青藤堿口服生物利用度低、不良反應多、需長期給藥。透皮給藥可以降低胃腸反應，減少副作用，尤其是在電致孔條件下可以加大透皮給藥量和透皮速率[2，3]。目前，對于青風藤體內外透皮給藥的研究已有報道[4～7]，但未見體內、外相關性的報道。本研究以青藤堿的透過量為考察指標，評價電致孔不同電學參數(shù)組合下青藤堿提取液的體內、外相關性，為以后進一步研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜(HPLC)儀，包括一元泵、自動進樣器、在線脫氣機、柱溫箱、SPD-10Avp檢測器、2010色譜工作站(日本島津公司)；電致孔藥物導入儀(西北大學電子科學系)；改良的Franz雙室擴散池(筆者自制)；78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠)；HL-2型橫流泵(鄭州南北儀器設備有限公司)；TGL-16型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；活體透皮儀(筆者自制)；XK96-A型快速混勻器(江蘇姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；微量移液器(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.2 試藥

青風藤提取液(筆者自制，1 mL藥液相當于0.5 g原藥材)；青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0774-200610)；肝素鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號:060502)；甲醇(分析純，天津四友生物醫(yī)學技術有限公司，批號:071221101)；氯仿(分析純，東莞市東江化學試劑有限公司)。

1.3 動物

100只昆明種小鼠，♀♂兼半，重量(20±2)g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(動物生產許可證號:SCXK(軍)2002-006)。

2 方法與結果

2.1 電致孔不同電學參數(shù)組合方法

電致孔藥物導入儀的電學參數(shù)包括脈沖電壓、脈沖時間、脈沖波形、脈沖頻率和脈沖數(shù)。本文對電致孔的不同電學參數(shù)即脈沖時間(A)、脈沖電壓(B)、波形(C)、脈沖頻率(D)、脈沖數(shù)(E)按照L16(45)正交表安排試驗。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1Factors and levels

2.2 體外透皮實驗

取體重合格的健康昆明種小鼠，脫頸處死，剪凈腹部的毛，然后剝離此處皮膚，小心剔除皮下脂肪組織，用蒸餾水沖洗干凈，選取角質層完好的皮膚備用。將處理好的皮膚夾于雙室擴散池中間，角質層面向供給池，真皮層面向接受池；將惰性圓盤狀電極分別置于兩個池中(正負電極間隔1.0 cm)，正極在供給池，負極在接受池；供給池加入青風藤提取液20 mL作為供給液，接受池中加入20 mL生理鹽水作為接受液。雙室擴散池固定在調溫恒控磁力攪拌器上，以恒定速度攪拌，并保持恒溫在(32±0.5)℃。試驗按照L16(45)正交表進行，每次透皮時間為30 min，透皮給藥結束后取出全部接受液，快速混勻器上混勻1 min，在3000 r·min-1的條件下離心5 min，經0.22μm微孔濾膜濾過，即得樣品。分別吸取樣品溶液20μL進樣測定青藤堿含量。每組試驗重復3次。

2.3 體內透皮實驗

取體重合格的健康昆明種小鼠，剪凈腹部的毛，選取皮膚完好者即用。將處理好的活體小鼠(腹部向上)固定在活體透皮儀的斜面上，將供給池放在擴散池支撐裝置上并與小鼠腹部無毛區(qū)接觸，然后用活體透皮儀連接帶把活體小鼠和供給池固定牢固；保持供給池恒溫在(32±0.5)℃；在供給池中加入青風藤提取液20 mL作為供給液，以活體小鼠作為接受池。試驗按照L16(45)正交表進行，每次透皮時間為30 min，透皮給藥結束后從小鼠眼眶取血0.5 mL，置肝素化的具塞離心管中，6000 r·min-1離心10 min，分離上層血清，加入0.1 mol·L-1的NaOH溶液0.2 mL混勻；用5 mL氯仿溶液萃取2次，合并萃取液，蒸干，用100μL甲醇溶解殘渣，取20μL進樣測定青藤堿含量。每組試驗重復3次。

2.4 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C1(8200 mm×4.6 mm，5μm)；流動相:甲醇∶(水-乙二胺＝300∶1)＝52∶48；檢測波長:262 nm；流速:1.0 mL·min-1。以青風藤的主要成分青藤堿為指標。

2.5 體外透皮實驗方法學考察

2.5.1 標準曲線的制備精密稱取干燥至恒重的青藤堿對照品5.01 mg，置于50 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容。精密吸取0.1、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用流動相定容，得到系列濃度的對照品溶液。取上述溶液各20 μL，進樣測定，記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝3644.9X+1054.6(r＝0.9994)。結果表明，青藤堿檢測濃度在1.0～100.1 μg·mL-1范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗參考線性范圍，配制濃度分別為1.0、50、100 μg·mL-1的青藤堿樣品，每次進樣10 μL進行含量測定。結果，日內差異(1 d內重復測定6次)，青藤堿含量RSD分別為1.26%、1.48%和1.35%；日間差異(每天測定1次，共測定6 d)，青藤堿含量RSD分別為1.81%、1.68%和1.61%。

2.5.3 回收率試驗精密吸取已知含量的樣品，加入不同量的青藤堿對照品溶液，配制成高、中、低3個濃度，各進樣10μL，每一濃度重復進樣5次，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算青藤堿的含量。結果，3個濃度的平均回收率分別為98.84%、97.65%、99.02%，RSD分別為3.15%、3.28%、3.62%。

2.6 體內透皮實驗方法學考察

2.6.1 線性關系考察精密量取空白大鼠血漿0.2 mL，置于5 mL帶塞肝素化的離心管中。用流動相配制濃度為4.0、10.0、20.0、40.0、100.0μg·mL-1的青藤堿對照品溶液，分別吸取50μL加入空白大鼠血漿中混勻，再加入0.1 mol·L-1的NaOH溶液0.2 mL混勻；用5 mL氯仿溶液萃取2次，合并萃取液，蒸干，100μL甲醇溶解殘渣，取20μL進樣測定含量。以峰面積積分值(A)為縱坐標，對照品濃度(c)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0589c+2.3654(r＝0.9973)。結果表明，青藤堿檢測濃度在4.0～100.0 μg·mL-1范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

2.6.2 精密度試驗參考線性范圍，配制濃度分別為4.0、10.0、20.0 μg·mL-1的青藤堿血漿對照品溶液，每次進樣10 μL進行含量測定。結果，日內差異(1 d內重復測定6次)，青藤堿含量RSD分別為5.1%、4.1%和4.9%；日間差異(每天測定1次，共測定6 d)，青藤堿含量RSD分別為5.6%、5.3%和6.1%。

2.6.3 回收率試驗精密吸取已知含量的樣品，分別加入不同量的青藤堿血漿對照品溶液，配制成高、中、低3個濃度，各進樣10μL，每一濃度重復進樣5次，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算青藤堿的含量。結果，3個濃度的平均回收率分別為96.64%、97.12%、96.02%，RSD分別為4.15%、3.88%、3.72%。

3 結果

3.1 電致孔不同電學參數(shù)組合下體內外實驗的青藤堿濃度

正交試驗結果見表2。

3.2 體內外透皮正交試驗方差分析

體內實驗方差分析結果見表3；體外實驗方差分析結果見表4。

由表3可知，因素A、B對電致孔透皮給藥有極顯著的影響，因素C對電致孔透皮給藥有顯著影響，因素D、E對電致孔透皮給藥無顯著的影響。選取顯著因素的最優(yōu)水平，得到體內實驗電致孔最優(yōu)電學參數(shù)條件為:A4B3C2D3E3，即脈沖時間1.3 ms、脈沖電壓300 V、波形為正弦波、脈沖頻率120個·min-1、脈沖數(shù)360個。

表2 正交試驗結果Tab 2Results of orthogonal tests

表3 體內實驗方差分析結果Tab 3Analysis of variance of in vivo tests

表4 體外實驗方差分析結果Tab 4Analysis of variance of in vitro tests

由表4可知，因素A、B、C對電致孔透皮給藥有極顯著的影響，因素D、E對電致孔透皮給藥無顯著影響。選取顯著因素的最優(yōu)水平，得到體外實驗電致孔最優(yōu)電學參數(shù)條件為A3B3C2D3E3，即脈沖時間1.2 ms、脈沖電壓300 V、波形為正弦波、脈沖頻率120個·min-1、脈沖數(shù)360個。

3.3 體內外透皮給藥的相關性分析

將上述體外實驗不同電致孔電學參數(shù)組合下青藤堿的透過濃度與對應的電致孔電學參數(shù)組合下的體內血藥濃度進行線性回歸。以體外透過濃度(X)為橫坐標，體內血藥濃度(Y)為縱坐標，得回歸方程為Y＝0.657518X－16.255(r＝0.9547)。對相關系數(shù)進行顯著性檢查，計算統(tǒng)計量12.05；在顯著水平α＝0.001、自由度為10的條件下，查得。因為，表明電致孔條件下青風藤提取液體內、外透皮實驗的相關性非常顯著。

4 討論

電致孔可以顯著地促進許多藥物的透皮吸收，故開發(fā)與電致孔相結合的新型透皮給藥系統(tǒng)引起了國內、外藥學界的關注。由于體內透皮研究難度較大，研究者往往利用體外實驗來探索藥物的體內透皮規(guī)律。然而只有在體內、外透皮實驗的相關性良好的情況下，體外實驗研究數(shù)據(jù)才能真正反映出體內的透皮規(guī)律。因此，需要進行透皮給藥體內、外相關性分析，考察體外實驗能否反映藥物的體內透皮規(guī)律。

本研究在基本保證實驗條件一致的情況下，利用正交試驗分別得到電致孔條件下青風藤提取液體內、外透皮實驗的最優(yōu)電學參數(shù)，比較發(fā)現(xiàn)二者只在脈沖時間上存在差異，差值僅為0.1 ms，可以忽略不計。因此，體外與體內透皮實驗的最優(yōu)條件基本一致。接著對體內、外透皮實驗相關性進行了分析，得到回歸方程為Y＝0.657518X－16.255(r＝0.9547)，由顯著性檢查可知體內、外相關性非常顯著(α＝0.001)。因此，體外實驗數(shù)據(jù)基本能夠反映藥物的體內透皮規(guī)律。

本研究方法具有一定的可行性，希望能夠為以后的進一步研究提供參考。由于體外測量數(shù)據(jù)明顯高于體內數(shù)據(jù)，最高可達4.3倍，為了保證臨床用藥的安全性，體外優(yōu)化的電致孔參數(shù)組合還要結合體內研究結果才能最終確定。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:181.

[2]李偉澤.中藥青風藤在電致孔條件下透皮給藥的研究[D].西安:西北大學，2007:14.

[3]姜翠敏，王旋.青藤堿游離堿凝膠體外經皮滲透特性研究[J].中國藥房，2008，19(30):2330.

[4]岳奇峰，郝保華，鄧周虎，等.電致孔條件下不同電學參數(shù)對青藤堿透皮給藥的影響[J].中草藥，2006，37(11):1639.

[5]李偉澤，郝保華，鄧周虎，等.電致孔條件下不同促滲劑對青藤堿透皮吸收的影響[J].中草藥，2006，37(12):1790.

[6]李凡，郝保華，唐斌斌，等.電致孔條件下巴布劑中青藤堿透皮吸收的藥動學研究[J].第二軍醫(yī)大學學報，2008，29(9):1096.

[7]郝保華，王彥玲，唐斌斌，等.青風藤電離巴布劑電致孔透皮給藥的藥動學研究[J].中草藥，2009，40(7):1060.