徐金龍，張紅梅，徐秀泉（.江蘇中興藥業(yè)有限公司，鎮(zhèn)江市22009；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市2203）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝

徐金龍1＊，張紅梅1，徐秀泉2#（1.江蘇中興藥業(yè)有限公司，鎮(zhèn)江市212009；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市212013）

目的：采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝。方法：固定提取時(shí)間，以乙醇濃度、料液比、提取溫度為響應(yīng)因子，總黃酮得率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝參數(shù)。結(jié)果：各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為料液比＞提取溫度＞乙醇濃度；牡丹皮總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，提取溫度55℃，料液比1∶40（W/V），在此條件下，牡丹皮總黃酮得率為3.11mg·g-1。結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值相符，該工藝可用于牡丹皮中總黃酮的提取。

牡丹皮；總黃酮；響應(yīng)面分析法；提取工藝

牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，性微寒，有清熱、涼血、活血、消瘀的功能，用以治療熱入血分、吐血、闌尾炎初起、跌打損傷等[1]。牡丹皮酚是其主要活性成分，具有抗菌消炎、抗過敏、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、抗腫瘤、抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保肝利尿等多種藥理作用[2～4]。近年來研究人員從牡丹皮中分離得到黃酮類化合物[5]，其中槲皮素、兒茶素、山柰素是清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、O2－自由基，抑制酪氨酸酶、高級糖化物終末產(chǎn)物（AGES）產(chǎn)生的主要活性成分[6，7]，但對牡丹皮中總黃酮的提取工藝研究國內(nèi)、外鮮見報(bào)道。本研究采用乙醇作為提取溶劑，選取乙醇濃度、提取溫度、料液比3個(gè)因素，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝，以期為牡丹皮的深入開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DHG-9145鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

牡丹皮（購自江蘇鎮(zhèn)江九泰醫(yī)藥有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)沈絳英副主任藥師鑒定為毛茛科芍藥屬植物牡丹的干燥根皮，干燥、粉碎過16目篩，備用）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200306）；藥用乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均購自國藥集團(tuán)。

2 方法

2.1 牡丹皮總黃酮含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.9mg，加70%乙醇溶解并定容至50mL，得218μg·mL-1蘆丁對照品溶液。量取該對照品溶液 0、1、2、3、4、5、6mL，置于25mL量瓶中，分別加入5%NaNO2、AlNO3各1mL，NaOH 10mL，每種試劑滴加間隔5min，最后用70%乙醇定容至25mL，于510nm波長處測定吸光度。以進(jìn)樣濃度（c）對吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0107c－0.008（r＝0.9996，n＝7）。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣濃度在8.72～52.32μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 牡丹皮總黃酮的提取及其含量測定 準(zhǔn)確稱取牡丹皮粉末1g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度的水浴中提取30min，離心后按“2.1.1”項(xiàng)下方法測定樣品吸光度，并按下式計(jì)算總黃酮得率：總黃酮得率＝（A－0.008）/0.0107×稀釋倍數(shù)/1000/M（式中，M是所取牡丹皮的量（g）；A是吸光度）。

2.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度3個(gè)因素對牡丹皮中總黃酮得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，隨著乙醇濃度的提高，黃酮類物質(zhì)得率也增加，在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到峰值，高于60%后，得率有較大程度下降，這可能由于牡丹皮中黃酮類化合物多為苷類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的極性，根據(jù)相似相溶原理，在60%左右的乙醇中溶解度較大的緣故；料液比為1∶40時(shí)的提取效果較好，提高料液比例，總黃酮得率略有增大，考慮節(jié)省溶劑消耗，選擇料液比為1∶40；在低于60℃的范圍內(nèi)隨著溫度的升高總黃酮得率隨之升高，說明較高的溫度對黃酮類化合物的溶出是有利的，當(dāng)超過60℃后，總黃酮得率變化不大，有下降的趨勢，這可能是由于在較高溫度下，溶劑揮發(fā)嚴(yán)重加之其他物質(zhì)也隨之溶出的緣故。各因素對牡丹皮中總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 各因素對牡丹皮中總黃酮得率的影響A.乙醇濃度；B.料液比；C.提取溫度Fig 1 Effect of yeild rate of total flavoniods of various factorsA.enthanol concentration；B.sample solvent ratio；C.extraction temperature

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)選提取工藝

2.3.1 試驗(yàn)安排與結(jié)果 根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，結(jié)合響應(yīng)面分析方法，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素5水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（其中14個(gè)為析因試驗(yàn)，3個(gè)為中心試驗(yàn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。對乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取溫度（X3）按下列公式進(jìn)行編碼：X1＝（X1－60）/20，X2＝（X2－30）/10，X3＝（X3－50）/10。響應(yīng)面因素水平編碼見表1；響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Tab 1 Factors and levels code of response surface

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of response surface methodology

2.3.2 模型方程的建立與方差分析 應(yīng)用Design-Expert 7.1.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取溫度（X3）與牡丹皮總黃酮之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y＝2.89+0.06X1+0.21X2+0.15X3－0.055X1X2+0.075X1X3－0.038X2X3－0.32X12－0.082X22－0.12X32。對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3（表中，＊＊＊表示P＜0.001，差異極顯著；＊＊表示P＜0.01，差異高度顯著；＊表示P＜0.05，差異顯著）。

由表3可知，一次項(xiàng)中料液比（X2）、提取溫度（X3）對總黃酮得率的線性效應(yīng)極顯著，乙醇濃度（X1）對總黃酮得率的線性效應(yīng)高度顯著，各因素對總黃酮得率的影響大小為X2＞X3＞X1；二次項(xiàng)中乙醇濃度（X1）、提取溫度（X3）對總黃酮得率的線性效應(yīng)極顯著，料液比（X2）對總黃酮得率的線性效應(yīng)高度顯著；交互項(xiàng)中乙醇濃度與料液比（X1X2）、乙醇濃度與提取溫度（X1X3）對總黃酮得率的線性效應(yīng)顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.9720，說明該模型能夠97.2%反映相應(yīng)值隨自變量的變化，模型擬合程度較好。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，回歸方程的失擬項(xiàng)檢測P＝0.4089＞0.05，不顯著；回歸方程顯著性檢測P＜0.0001，極顯著，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取工藝提取牡丹皮總黃酮是可行的。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 提取過程中，各因素對總黃酮得率影響的二維等高線和三維響應(yīng)曲面見圖2。

表3 牡丹皮總黃酮得率方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis of yeild rate of total flavoniods of P.suffruticosa

圖2 各因素對牡丹皮總黃酮得率影響的二維等高線和三維響應(yīng)曲面圖A.乙醇濃度與料液比；B.乙醇濃度與提取溫度；C.料液比與提取溫度Fig 2 Response surface and contour plots for the effects of variables on the rate of the total flavonoids from P.suffruticosaA.ethanol concentration and ratio of material to liquid；B.ethanol concentration and extraction temperature；C.ratio of material to liquid and extraction temperature

由圖2可知，提取溫度和料液比能夠顯著促進(jìn)總黃酮的溶出，表現(xiàn)為隨溫度和料液比的升高，總黃酮得率提高；隨乙醇濃度的增加，總黃酮得率先升高后降低，說明黃酮類化合物具有一定的極性，根據(jù)相似相溶原理，只有在一定濃度的乙醇中才能夠最大程度溶出。

2.3.4 提取工藝條件的確定 為驗(yàn)證牡丹皮總黃酮提取模型方程的適用性，對回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)主要因素的最佳水平值，分別為：X1＝0.06、X2＝1.00、X3＝0.49，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為：乙醇濃度61.2%、料液比1∶40（W/V），提取溫度54.9℃，預(yù)測牡丹皮總黃酮得率為3.05mg·g-1。為方便試驗(yàn)，調(diào)整方案為乙醇濃度60%，料液比1∶40（W/V），提取溫度55℃，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算牡丹皮總黃酮得率，求其平均值為3.11mg·g-1。實(shí)際測得與預(yù)測的總黃酮得率較為接近，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面分析方法適用于牡丹皮總黃酮提取工藝的優(yōu)化。

3 討論

響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸的方法，將多因子試驗(yàn)中因子指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于各種生物處理過程的優(yōu)化[8]。在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對牡丹皮總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可較準(zhǔn)確的預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，使試驗(yàn)從設(shè)計(jì)到結(jié)果分析都準(zhǔn)確、可靠，可見響應(yīng)面分析法是優(yōu)化中藥提取工藝的有效方法。

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Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids from Paeonia suffruticosa by Response Surface Methodology

XU Jin-long，ZHANG Hong-mei（Jiangsu Zhongxing Pharmaceutical Limited Company，Zhenjiang 212009，China）XU Xiu-quan（College of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total flavonoids from Paeonia suffruticosa by response surface methodology.METHODS：The extraction time was fixed，the parameters of extraction technology of total flavonoids from P.suffruticosa were optimized by three factors and three levels response methodology using ethanol concentration，ratio of material to liquid and extraction temperature as the response factors and with yeild rate of total flavonoids as response value.RESULTS：The effects of factors in the descending order were as follows：ratio of material to liquid，extraction temperature and ethanol concentration.The optimal extraction technology was as follows：ethanol concentration 60%，extraction temperature 55℃，and ratio of material to liquid 1∶40（W/V）.Under these conditions the maximal yield of total flavonoids reached 3.11mg·g-1.CONCLUSION：The results are agreed with model predictions.The technology can be used as the extraction process of total flavonoids from P.suffruticosa.

Paeonia suffruticosa；Total flavonoids；Response surface methodology；Extraction technology

R284.2；R283

A

1001-0408（2011）27-2536-03

2010-09-05

2010-12-26）