陽雋，張?zhí)焱?，朱家馨?.廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州市51060；.中山大學第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州市 510630）

近年來隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量使用及侵入性治療的開展，念珠菌感染呈增多趨勢。白色念珠菌可在黏膜及各類導管支架的表面形成生物膜，生物膜是一種由融合的基底芽生孢子層、菌絲成分和細胞外多聚基質(zhì)3部分組成的結(jié)構(gòu)群體，可以逃避宿主免疫作用，具有極強的耐藥性。生物膜態(tài)白色念珠菌相關(guān)感染是臨床治療上的難點?？ú捶覂羰且环N新型的棘白菌素類抗真菌藥物，作用機制為抑制β-（1，3）-D-葡聚糖的合成，體外研究[1～4]顯示卡泊芬凈對生物膜態(tài)白色念珠菌有抑制作用，但對于卡泊芬凈的有效濃度各實驗室報道不一。因此，本研究選取了10株已證實的可黏附生長形成生物膜態(tài)白色念珠菌的臨床分離株，分別檢測卡泊芬凈對生物膜態(tài)白色念珠菌的抑菌作用，以探討臨床治療生物膜態(tài)白色念珠菌相關(guān)感染的最適治療劑量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TE2000U倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ELX800全自動酶標儀（美國BioTek公司）；EVO 50電子顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品

注射用醋酸卡泊芬凈（以下簡稱卡泊芬凈，美國默克公司，批號：J6253，規(guī)格：每支50 mg）。

1.3 菌株

白色念珠菌臨床分離株均分離自中山大學第三附屬醫(yī)院呼吸實驗室收集的臨床痰液標本，試驗共收集了54株，并篩選出10株黏附生長明顯、能形成典型生物膜態(tài)白色念珠菌的菌株進行藥敏試驗，菌株編號為 13860、13874、13879、14215、14813、15086、15346、15538、16308、16335。質(zhì)控菌株：白色念珠菌（ATCC90 028、ATCC64 550）由中山大學第三附屬醫(yī)院呼吸實驗室保存。

1.4 培養(yǎng)基

科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基（法國CHROMagar公司產(chǎn)品，批號：100517）、沙堡氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：100608）均由廣東江門凱林貿(mào)易有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：785914）。

2 方法

2.1 貯備液的制備

取卡泊芬凈適量，用滅菌水溶解，并稀釋成濃度10 mg·mL－1貯備液，于－20℃分裝保存，備用。

2.2 菌株的鑒定與保存

取臨床分離株經(jīng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基及芽管實驗鑒定為白色念珠菌，將鑒定分純的白色念珠菌單個菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD，組成：1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖），振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液800μL與滅菌甘油200μL充分混勻，放置于－70℃冰箱保存，備用。

2.3 生物膜態(tài)白色念珠菌的形成

取出凍存的白色念珠菌接種于SDA平板，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上生長的白色念珠菌單個菌落接種于YPD中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次，加入RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為1×106個/L，接種于放置有20 mm×20 mm聚乙烯細胞爬片的6孔細胞培養(yǎng)板中，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，PBS漂洗2次，洗去未黏附菌細胞，置于倒置顯微鏡下觀察生物膜態(tài)白色念珠菌的結(jié)構(gòu)。另將PBS漂洗后的細胞爬片于2%戊二醛中固定3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，再用50%、70%、80%、90%、95%乙醇逐級脫水，各15 min，然后換叔丁醇脫水15 min，經(jīng)臨界點干燥鍍膜處理后于電子顯微鏡下觀察生物膜態(tài)白色念珠菌的結(jié)構(gòu)。

2.4 游離態(tài)白色念珠菌藥敏試驗

選用美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）M27-A方案的微量液體稀釋法，采用倍比稀釋法稀釋藥液，取卡泊芬凈貯備液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至濃度為0.063～32 mg·L－1作為試驗孔，并設(shè)立不含藥物的陽性對照和無菌培養(yǎng)基空白對照。加入白色念珠菌（即游離態(tài)白色念珠菌）或質(zhì)控菌株35℃培養(yǎng)48 h后，于酶標儀520 nm波長處測定各孔吸光度（A），并計算Y值＝（各試驗孔A值－空白對照A值）/陽性對照A值，Y值越大，白色念珠菌的增殖活性越強。當Y值＜0.5時的最低卡泊芬凈濃度即為半數(shù)抑菌濃度（MIC50），試驗設(shè)3個復孔。

2.5 生物膜態(tài)白色念珠菌藥敏試驗

[5]報道的方法進行，將白色念珠菌接種于96孔細胞培養(yǎng)板上黏附生長24 h，PBS漂洗3次，去除未黏附菌細胞。加入用RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋的卡泊芬凈，濃度為0.25～256 mg·L－1[4]作為試驗孔，并設(shè)立不含藥物的陽性對照。35℃培養(yǎng)48 h，采用四唑鹽（XTT）減低法檢測菌細胞增殖活性，于酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度，每株菌取4個復孔檢測，取其平均值，并計算Y值＝各試驗孔A值/陽性對照A值，Y值越大，白色念珠菌的增殖活性越強。當Y值＜0.5時的最低卡泊芬凈濃度為MIC50。

3 結(jié)果

3.1 生物膜態(tài)白色念珠菌的結(jié)構(gòu)

白色念珠菌分離株可在聚乙烯細胞爬片上黏附生長形成生物膜。倒置顯微鏡下可見生物膜態(tài)白色念珠菌主要由菌絲細胞構(gòu)成，間有孢子，具體見圖1；電子顯微鏡下可見生物膜態(tài)白色念珠菌具有菌絲交錯的三維立體空間結(jié)構(gòu)，具體見圖2。

3.2 游離態(tài)白色念珠菌藥敏試驗結(jié)果

圖1 倒置顯微鏡下生物膜態(tài)白色念珠菌結(jié)構(gòu)圖（20×10）Fig 1 Inverted microscope image of Candida albicans biofilm（20×10）

圖2 電鏡下生物膜態(tài)白色念珠菌結(jié)構(gòu)圖（×3 000）Fig 2 SEM image of Candida albicans biofilm（×3 000）

卡泊芬凈對10株游離態(tài)白色念珠菌及質(zhì)控菌株的MIC50為0.125～0.5 mg·L－1，MIC50中位數(shù)為0.25 mg·L－1。當卡泊芬凈濃度高于游離態(tài)白色念珠菌MIC50時，10株游離態(tài)白色念珠菌的增殖活性幾乎完全受到抑制?？ú捶覂魧?0株游離態(tài)白色念珠菌的MIC50值詳見表1。不同濃度卡泊芬凈作用下游離態(tài)白色念珠菌的增殖活性比較見圖3。

圖3 不同濃度卡泊芬凈作用下游離態(tài)白色念珠菌的增殖活性比較Fig 3 Metabolic activity of planktonic cells of C.albicans at different concentrations of caspofungin

3.3 生物膜態(tài)白色念珠菌藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果表明，卡泊芬凈對10株生物膜態(tài)白色念珠菌的MIC50為 0.25～256 mg·L－1，其中有 8株生物膜態(tài)白色念珠菌MIC50≤2 mg·L－1，MIC50中位數(shù)為1 mg·L－1。當卡泊芬凈濃度高于生物膜態(tài)白色念珠菌MIC50時，有7株生物膜態(tài)白色念珠菌（編號13860、13879、14813、15086、15538、16308、16335）的增殖活性再次增強，且大于陽性對照的50%?？ú捶覂魧?0株生物膜態(tài)白色念珠菌的MIC50值詳見表1。不同濃度卡泊芬凈作用下生物膜態(tài)白色念珠菌的增殖活性比較見圖4。

表1 卡泊芬凈對游離態(tài)及生物膜態(tài)白色念珠菌的MIC50值Tab 1 MIC50of caspofungin against planktonic cells and biofilm-associated adherent cells of Candida albicans

圖4 不同濃度卡泊芬凈作用下生物膜態(tài)白色念珠菌的增殖活性比較Fig 4 Metabolic activity of biofiom cells of C.albicans at different concentrations of caspofungin

4 討論

本研究結(jié)果顯示，10株游離態(tài)白色念珠菌對卡泊芬凈敏感，MIC50為0.125～0.5 mg·L－1，而治療劑量的卡泊芬凈靜脈滴注，平均血藥濃度為12.4 mg·L－1，24 h后為1.42 mg·L－1[6]，提示體內(nèi)卡泊芬凈對游離態(tài)白色念珠菌具有良好的抗菌作用。

卡泊芬凈對10株生物膜態(tài)白色念珠菌的MIC50為0.25～256 mg·L－1，其中8株≤2 mg·L－1，表明臨床治療劑量的卡泊芬凈對大部分生物膜態(tài)白色念珠菌有抑菌作用。但有研究[1～4]報道卡泊芬凈對生物膜態(tài)白色念珠菌的有效濃度差異較大，考慮可能與所用菌株不同相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，當卡泊芬凈濃度高于生物膜態(tài)白色念珠菌MIC50時，有7株生物膜態(tài)白色念珠菌的增殖活性再次增強，而更高濃度的卡泊芬凈（256 mg·L－1）對生物膜態(tài)白色念珠菌的抑菌作用有再次增高趨勢，與國外文獻報道基本一致[7，8]，但其可能機制目前尚不明確。

綜上所述，臨床治療劑量的卡泊芬凈對游離態(tài)白色念珠菌有良好的抑菌作用，對生物膜態(tài)白色念珠菌也有抑菌作用，但不呈濃度依賴性，當其濃度高于MIC50時抑菌作用出現(xiàn)下降現(xiàn)象，此現(xiàn)象對臨床治療的影響目前尚不清楚。在將其用于治療生物膜態(tài)白色念珠菌相關(guān)感染時，最適治療劑量有待臨床研究驗證。

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