高光平,張艷英,高桂生,湯生玲,史秋梅,梁銀聚,邵欣華

(1.河北科技師范學院動物科技學院河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室,河北 昌黎 066600;2.河北新華科極獸藥有限公司,河北 石家莊 051430)

大腸桿菌是禽類常見的腸道條件致病菌。中草藥在我國資源豐富,價格低廉,相對于抗生素和化學合成藥物而言,含有多種藥效成分,具有多靶點、毒性較低、不易產生耐藥性等特點,在防病治病的同時,還具有促進動物生長、增強機體免疫力、提高整體抗病能力等作用,且使用后也不會影響禽產品的食用安全性與食用品質,符合當今社會倡導的綠色養(yǎng)殖主題,有著廣闊的發(fā)展前景。

近年來,有關中藥抗大腸桿菌病的作用研究有許多報道[1-2]。但是應用藥物敏感性試驗和最小抑菌濃度兩種方法綜合評價中藥口服液對大腸桿菌的體外抑制作用較少見于報道。本次試驗通過藥物的敏感性和最小抑菌濃度對中藥口服液體外抑制大腸桿菌O78的效果進行了初步的探究,二者綜合判斷其抑菌效果,為臨床用藥打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 雞源性大腸桿菌標準菌種(O78)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 藥品 大青止瀉口服液:由大青葉、黃柏、烏梅、訶子組成;白頭翁口服液:由白頭翁、黃連、大黃、甘草組成;雙連固腸口服液:由金銀花、穿心蓮、黃芪、秦皮組成。以上中藥均購自昌黎縣民生藥店。藥敏紙片購自北京天壇生物藥物技術開發(fā)公司:頭孢他啶(30μg,0903061),頭孢吡肟(30 μg,0908221),頭孢曲松(30μg,0811261),頭孢噻肟(30μg,0812171),丁胺卡那霉素(30μg,0902201),氟哌酸(10μg,0903181),環(huán)丙沙星(5μg,0902271),慶大霉素(10 μg,0902181),克林霉素(2 μg,0902251)。

1.3 試劑 營養(yǎng)瓊脂,國藥集團化學試劑有限公司(0906251);營養(yǎng)肉湯,國藥集團化學試劑有限公司(0901061)。

1.4 試驗儀器 高壓蒸汽滅菌鍋、中藥煎藥機、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、旋轉蒸發(fā)器等。

1.5 中藥口服液的制備 將3種方劑的中藥分別混勻后,裝入無紡布袋,清水浸泡30 min,加熱煮沸30 min,過濾,藥渣再加清水煮沸20 min,過濾,合并二次濾液后濃縮至生藥含量1 g/m L,121℃滅菌20 min,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌種準備 將試驗菌種接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18 h,然后挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)典型菌落于3 m L生理鹽水中,混勻后與菌液比濁管比濁,調整濁度與比濁管(0.5麥氏單位)相同。

1.7 藥物敏感性試驗

1.7.1 打孔法 于無菌平皿內加入約25 m L營養(yǎng)瓊脂,凝固后用無菌棉拭子蘸取已配制好的細菌混懸液涂布整個營養(yǎng)瓊脂表面。用直徑為0.6 cm的無菌打孔器在培養(yǎng)基上打孔,在孔內加入1 g/mL生藥的口服液,以加滿而不溢出孔外為宜。每種藥液做3個平皿,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑。判定標準:抑菌圈直徑＜8 mm,為不敏感,記為(-);抑菌圈直徑8～13 mm之間,為低度敏感,記為(+);抑菌圈直徑在13～19 mm之間,為中度敏感,記為(++);抑菌圈直徑在＞19 mm,為高度敏感,記為(+++)[3]。

1.7.2 K-B紙片法 于無菌平皿內加入約25 mL營養(yǎng)瓊脂,凝固后用無菌棉拭子蘸取已配制好的細菌混懸液涂布整個營養(yǎng)瓊脂表面取藥敏紙片貼在平板表面,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈的直徑。判定標準采用美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的判斷標準表示[4]。

1.8 藥物的最小抑菌濃度(MIC)試驗 管碟法:取13×100 mm滅菌試管11支,編號,每管加入無菌肉湯培養(yǎng)基2 m L,然后于第1管中加入受試中藥口服液2 m L,混勻后取出2 m L加入第2管中,以此類推,直到第9管中取出2 m L棄去,第10管不加藥液作陽性對照,第11管加入受試藥液2 mL,混勻后取2 mL棄去,不加細菌作陰性對照。將培養(yǎng)8 h的試驗菌液,用無菌肉湯稀釋成原溶液的10-3倍濃度,分別取 0.1 mL加入上述1～10號試管中[5]。從上述11個試管中分別取1 m L液體加入11個滅菌的平皿中,將滅菌處理的冷卻至40℃的營養(yǎng)瓊脂分別倒入上述11個平皿中,晃動平皿使之混合均勻,瓊脂凝固后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察平皿中菌落數(shù)量,試驗重復3次,以無菌落生長平板的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibiting concentrations,MIC)[6-7]。

2 結果與分析

2.1 藥物敏感性試驗結果 大青止瀉口服液、白頭翁口服液、雙連固腸口服液對大腸桿菌O78均有較好的抑制作用,其中大青止瀉口服液抑菌效果最強;白頭翁口服抑菌效果較弱;西藥對照組中,大腸桿菌O78對丁胺卡那霉素、氟哌酸、頭孢類抗生素高度敏感;對環(huán)丙沙星、慶大霉素、克林霉素耐藥。藥敏試驗結果見表1。

2.2 藥物MIC試驗結果 大青止瀉口服液的MIC為0.031 g/mL(1∶32),白頭翁口服液的MIC為0.25 g/mL(1∶4),雙連固腸口服液的 MIC為0.063 g/mL(1∶16)。藥物MIC測定結果見表2。

表1 藥物敏感性試驗結果

表2 藥物MIC測定結果

3 討論

在測定MIC時,本試驗采用了管碟法。由于中草藥是有顏色的,因此,本試驗中所設陰性對照并非常規(guī)的培養(yǎng)基對照而是含有藥液的培養(yǎng)基,并且采用瓊脂平板計數(shù),以消除上述不利因素,確保了結果判定的準確性。劉玉慶等在測定MIC時,采用了平板稀釋法[2],簡化了試驗操作,但這種方法不能最大限度提高中藥濃度,對于高MIC中藥測定不利;管碟法結合了試管法濃度高、準確性好及平板法顯示穩(wěn)定的優(yōu)點,比較適合中藥MIC的測定。Seishi Matsumura等在測定黃芩對致齲細菌的最小抑菌濃度時,也同樣采用了管碟法,效果良好[8]。

4 結語

4.1 藥物敏感性試驗表明,自擬的大青止瀉口服液、白頭翁口服液、雙連固腸口服液對大腸桿菌O78均具有較好的抑菌作用,且大青止瀉口服液和雙連固腸口服液的抑菌效果較白頭翁口服液好。自擬的口服液雖然比頭孢菌素類的抑菌效果弱,但是比慶大霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星的抑菌效果好。

4.2 3種方劑的MIC試驗結果表明,大腸桿菌O78對大青止瀉口服液和雙連固腸口服液更敏感,大青止瀉口服液的最小抑菌濃度是0.031 g/m L,白頭翁口服液和雙連固腸口服液的最小抑菌濃度分別是0.25 g/m L,0.063 g/m L。

3種方劑的藥物敏感性結果與MIC試驗結果一致。綜上所述,3種方劑對大腸桿菌O78均有較好的體外抑制作用,其中大青止瀉口服液效果最佳,雙連固腸口服液次之。

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[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:65-87.

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