王 帥 陳根元 吳書(shū)奇 張 玲 馬春暉 胡建軍

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300)

小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是豆科棘豆屬植物，有醉馬草(新疆策勒、輪臺(tái))、苦馬豆(新疆莎車(chē))等多種俗稱(chēng)[1－3]。在牧草缺乏的冬季和初春，如果家畜大量采食，就會(huì)引起中毒甚至死亡。新疆阿克蘇地區(qū)每年因采食小花棘豆中毒而死亡的家畜達(dá)5%～10%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%[3]，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。

小花棘豆的主要有毒成分是吲哚里西啶生物堿－苦馬豆素(Swainsonine，以下簡(jiǎn)寫(xiě)為SW)，SW是一種非蛋白毒素，分子量?jī)H為173，本身不具有免疫原性，屬于半抗原。本研究通過(guò)化學(xué)合成的方法將SW與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合為SW－BSA偶聯(lián)物，通過(guò)免疫學(xué)途徑使免疫小鼠產(chǎn)生效價(jià)較高的抗體，為小花棘豆的安全利用奠定理論基礎(chǔ)。

1.1 試驗(yàn)材料、動(dòng)物與試劑

SW由兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備;溴乙酸、N－羥基琥珀酰亞胺、乙二醇二甲醚、二環(huán)己基碳二亞胺、異丙醇、聚乙二醇、BSA等均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純。

昆明種清潔級(jí)小白鼠40只，雌雄各半，體重(20±2 g)，購(gòu)自塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

Carry100型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(Varian Australia PTY LTD)、X－6型精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京福凱儀器有限公司)、Nicolet380(k)型付立葉紅外光譜分析儀(美國(guó)熱電)、TRACE GC ULTRA DSQ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)菲尼根)、LGJ3.0－Ⅱ型冷凍干燥機(jī)(美國(guó)AO公司)、DYY－10C型電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng))等。

1.3 SW－BSA的制備

SW－BSA的制備方法參考童德文等[4]和陳新萍等[5]的研究，首先將溴乙酸與N－羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活性酯(圖1)，再與SW合成為N－羧甲基苦馬豆素(季銨鹽)(圖2)，然后與BSA縮合，透析后冷凍干燥即為SW–BSA(圖3)。中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物采用熔點(diǎn)(MP)、紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、元素分析等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1 活性酯的合成

圖2 N－羧甲基苦馬豆素(季銨鹽)的合成

圖3 SW－BSA的合成

1.4 SW－BSA偶聯(lián)率的計(jì)算

制備的SW－BSA偶聯(lián)物通過(guò)SDS－PAGE電泳檢測(cè)分子量，通過(guò)測(cè)得的分子量計(jì)算SW與BSA的偶聯(lián)率[6，7]。

1.5 SW－BSA免疫效果的檢測(cè)

1.5.1 小鼠免疫試驗(yàn)免疫實(shí)驗(yàn)參考童德文等[4]和陳創(chuàng)夫等[8]的研究，準(zhǔn)確稱(chēng)量制備的SW－BSA 0.25 mg，用弗氏完全佐劑和生理鹽水的混合液(體積比1:1)充分乳化。得到抗原質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，用于首次免疫。第2次和第3次免疫用弗氏不完全佐劑和生理鹽水的混合液(體積比1:1)，配制的抗原濃度為0.5 mg/mL。第4次免疫只使用生理鹽水，配制的抗原濃度為1.0 mg/mL。

將40只實(shí)驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為四組，即SWBSA免疫組、BSA對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、陰性對(duì)照組。小鼠免疫劑量0.2 mL/只，背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周免疫1次，共免疫4次;BSA對(duì)照組免疫程序和劑量SW－BSA免疫組相同，僅將SW－BSA替換為等量的BSA;佐劑對(duì)照組僅注射弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑;陰性對(duì)照組不做任何處理。小鼠第4次免疫1周后斷尾采血，分離血清，測(cè)定抗體效價(jià)。

1.5.2 小鼠血清抗體效價(jià)的測(cè)定以SW作為包被抗原，用間接ELISA法測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)[4－7]。以3μg/mL的SW包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過(guò)夜;PBST洗滌3次，然后用15 g/L的明膠封閉，100μL/孔，37℃培養(yǎng)1 h;PBST洗滌3次后，加入1:200倍稀釋的小鼠血清100μL/孔，37℃培養(yǎng)1 h;PBST洗滌3次后，再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(工作濃度1:10 000)100μL/孔，37℃培養(yǎng)1 h;PBST洗滌3次后，加TMB 100μL/孔，37℃培養(yǎng)30 min，然后再加入2 mol/L的H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。測(cè)量樣品OD450值(P)與陰性對(duì)照孔OD450值(N)，以P/N＞2.1判定樣品為陽(yáng)性。

1.6 數(shù)據(jù)分析及采用軟件

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One–Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性酯的制備結(jié)果

得到白色的活性酯MP為155℃。紫外–可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描(溶劑為去離子水)最大吸收峰為212 nm(圖4)。MS鑒定(m/e，圖5):237(母核);201(237－2H2O);178(201－2C－1H);140(BrCH2COO－出峰);98(琥珀酰亞胺環(huán)出峰);56(基峰)。根據(jù)MP、UV、MS結(jié)果，并與文獻(xiàn)資料[4，10，11]進(jìn)行比對(duì)，該白色結(jié)晶即為所需要的活性酯?；钚怎ギa(chǎn)率為82%。

2.2 季銨鹽的合成結(jié)果

制備的N－羧甲基苦馬豆素MP為324℃。紫外–可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描(溶劑為去離子水)最大吸收峰為208 nm(圖6)。IR最大吸收峰(KBr壓片，cm－1，圖7):3 335.75(羥基);2 941.55(次甲基);2 703.65、2 562.92(酯基);1 759.82、1 722.99(母核);1 082.51(羰基)。產(chǎn)物所有基團(tuán)在圖中都有出峰。元素分析結(jié)果見(jiàn)表1。N、C和H的理論和測(cè)定百分含量之差分別為0.05%、0.07%和0.04%，均在誤差范圍內(nèi)，H值稍高而N和C值稍低，可能是樣品中含極少量水的緣故[4，10，11]。根據(jù)MP、IR、UV和元素分析結(jié)果判定，白色粉末狀物即為所要制備的季銨鹽。該產(chǎn)物真空干燥后產(chǎn)率為86%，具有較強(qiáng)的吸水性。

2.3 SW－BSA的合成結(jié)果

透析袋中的產(chǎn)物凍干后呈白色針狀結(jié)晶，按BSA計(jì)算，產(chǎn)率為91%。紫外光譜分析表明在265 nm處(圖8)有最大吸收峰。208 nm處為未偶聯(lián)的季銨鹽。

2.4 SW－BSA偶聯(lián)率的計(jì)算結(jié)果

根據(jù)SW－BSA的電泳圖(圖9)，可以看出樣品條帶單一，可判斷其純度較高。其條帶處在分子量29.0 kDa附近，說(shuō)明合成的SW－BSA分子量約為29.0 kDa。根據(jù)分子量計(jì)算[6，7]可得出平均每個(gè)BSA分子上結(jié)合了47個(gè)左右的季銨鹽分子。

圖4 活性酯的紫外－可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

圖5 活性酯的質(zhì)譜圖

圖6 季銨鹽的紫外－可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

圖7 季銨鹽的紅外光譜圖

表1 季銨鹽元素分析結(jié)果

圖8 SW－BSA的紫外－可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

圖9 SW－BSA的SDS－PAGE電泳圖M蛋白質(zhì)低分子量MARK;1 SW－BSA樣品

2.5 小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

用制備的人工抗原SW－BSA免疫小鼠，間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)。由表2可知，免疫組小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗體，抗體效價(jià)為211;BSA對(duì)照組、佐劑對(duì)照組和陰性對(duì)照組P/N值均小于2.1，未檢測(cè)到抗苦馬豆素抗體。說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)制備的SWBSA可引起小鼠的免疫應(yīng)答，具有較好的免疫原性。

3 討論

苦馬豆素的分子量較小，是一種半抗原，與大分子載體蛋白連接后，可成為完全抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[4，9，10]。為了避免大分子蛋白對(duì)苦馬豆素分子的屏蔽作用，本實(shí)驗(yàn)將苦馬豆素先與溴乙酸制備的活性酯反應(yīng)，生成季銨鹽(N－羧甲基苦馬豆素)后再與蛋白質(zhì)結(jié)合，這樣在SW與BSA之間提供了一個(gè)“－CH2CO－”的“臂”，可以起到避免屏蔽的作用。SW與BSA的結(jié)合位點(diǎn)選擇在SW的N4原子上，是考慮到SW上的羥基(處于SW的1，2，8位)可能是其抗原決定簇，N4原子與BSA結(jié)合后不影響抗原決定簇，易于產(chǎn)生高特異性的抗體。宋毓民等[7]選用對(duì)氯甲基苯甲酸作為間隔臂，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的免疫效價(jià)有所提高，可能在偶聯(lián)率相近的情況下，間隔臂的不同會(huì)導(dǎo)致人工抗原免疫效價(jià)的不同。半抗原能否產(chǎn)生高特異性的抗體不僅決定于它與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，而且取決于蛋白質(zhì)分子上連接的半抗原數(shù)目。BSA上有60個(gè)左右的游離氨基團(tuán)，其中必須有20個(gè)以上的游離氨基團(tuán)與半抗原結(jié)合，才可以誘導(dǎo)出半抗原的免疫原性[9－14]。偶聯(lián)率太低常引起無(wú)關(guān)的免疫應(yīng)答，偶聯(lián)率過(guò)高易誘導(dǎo)低特異性抗體的產(chǎn)生。余傳霖等[15]認(rèn)為半抗原與載體的偶聯(lián)比在3～45時(shí)為好。根據(jù)稅媛媛等[9]的研究，不同偶聯(lián)率的SW－HSA均可誘導(dǎo)抗SW抗體的產(chǎn)生，而且偶聯(lián)率在一定范圍內(nèi)的增大有助于提高免疫效價(jià);本實(shí)驗(yàn)合成的SW－BSA偶聯(lián)率較大，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)為211，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)合成的SWBSA具有較好的免疫原性。而宋毓民等[11]認(rèn)為偶聯(lián)率在1:20.2時(shí)人工抗原具有較好的免疫原性，偶聯(lián)率接近1:30時(shí)免疫原性較差;與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在一定的差異。這可能與SW－BSA的合成方法不同有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中間隔臂為2個(gè)碳長(zhǎng)度，而宋毓民等[7]采用對(duì)氯甲基苯甲酸作為間隔臂，并在其中間隔臂中引入苯環(huán)，可能改變了SW與BSA的空間位阻效應(yīng)，從而造成了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

表2 間接ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)P/N

實(shí)驗(yàn)對(duì)用于人工抗原合成的SW的純度要求較高，如果SW純度很低，會(huì)對(duì)SW的結(jié)合率產(chǎn)生不良影響;而且部分雜質(zhì)也可能與BSA發(fā)生反應(yīng)，達(dá)不到誘導(dǎo)出SW特異性抗體的目的[4]。本論文研究所用的苦馬豆素，是從小花棘豆中分離得到的，并經(jīng)過(guò)NMR、MS、IR和MP鑒定[2]，具有很高的純度，可以滿(mǎn)足人工抗原合成的要求。

致謝:在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，作者對(duì)塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院白紅進(jìn)教授、孫紅專(zhuān)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師、劉新華實(shí)驗(yàn)師在物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定方面提供的幫助表示感謝!

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