陳喜英 谷 勇

(中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，昆明，650224)

熊 智 殷 瑤 董 平

(西南林業(yè)大學) (中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所) (中國石油天然氣股份有限公司石油化工研究院)

土壤微生物對維持土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性、健康和質量非常關鍵［1］，對植物生長具有重要作用［2］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一，微生物數(shù)量多，土壤生物活性強，土壤養(yǎng)分供給充足，可以作為評價土壤肥力的重要指標之一［3-6］。土壤中細菌、放線菌、真菌三大類微生物比例是土壤肥力的一個衡量指標，土壤中細菌、放線菌密度高，表明土壤肥力水平高。土壤微生物群落結構的變化會直接影響土壤功能的發(fā)揮［7］。目前，對麻瘋樹(Jatropha curcas L.)林地土壤細菌的研究少有報道，對林地土壤微生態(tài)環(huán)境的認識比較模糊。因此對不同林齡麻瘋樹林地土壤細菌進行研究很有必要，本研究采用空間序列代替時間序列的方法，探討了位于永勝縣不同發(fā)育階段麻瘋樹林地土壤細菌數(shù)量及類群的變化，分析了其與土壤養(yǎng)分的關系，進一步為麻瘋樹林地土壤肥力的變化、養(yǎng)分的轉化及麻瘋樹林地的健康評價提供科學依據。

1 試驗地概況

試驗地位于云南省麗江市永勝縣熱河，東經100°33'34.1″～100°36'44.9″，北緯 26°6'3.6″～26°15'31.0″，海拔 1 230 m，屬低緯山地季風氣候類型。年平均氣溫13.5℃，最冷月平均氣溫6.1℃，最熱月平均氣溫19.0℃，極端最高氣溫32.3℃，極端最低氣溫-11.2℃。年平均降水924 mm，年平均日照時間2 403.6 h。年平均相對濕度67%。采樣地的土壤植被等基本情況見表1。

2 材料與方法

土樣的采集：2010年8月在永勝縣從1～10、11～20、21～30年生麻瘋樹林地選擇3塊樣地。采集麻瘋樹林地0～30 cm的土壤，5 cm為一個層次，共7個層次。采用土壤剖面取樣法，自下而上取樣，每層取2份樣，每份大約取10 g，一份裝入密封袋用于細菌的測定，另一份裝在鋁盒中用于含水率的測定［8］。同時在此剖面中取測定營養(yǎng)元素的土樣，將各土層的樣品混合在一起，在實驗室自然風干后送到云南省林業(yè)科學院重點實驗室進行分析。

主要儀器和試劑：細菌培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物公司。16SrDNA的PCR引物正向為27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAGGCT-3';反向為 1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'［9］。由上海生工生物工程技術公司合成。選擇Hin dⅢ酶、HaeⅢ酶、Hin fⅠ酶進行酶切，所有的酶全部購自Fermentas公司。采用Bio-RAD的Gel Doc-2000凝膠影像系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照。

表1 樣地的土壤植被概況

土壤含水量的測定：稱取待測土樣經105℃烘干8 h，至于干燥器中，待冷卻后稱質量，土壤含水量=(濕土質量-干土質量)/濕土質量 ×100%［10］。

土壤細菌的測定：①倒平板。將制備好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌后，把培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后成平板，備用。②制備土壤稀釋液。從每個土層中稱取土樣1 g放入盛9 mL無菌水的試管中充分混勻，制成10-1的土壤懸液，然后按10倍法依次稀釋至10-6。根據預實驗，選擇10-6的稀釋液，做3個重復。③涂布、培養(yǎng)和計數(shù)。用移液槍從試管中抽取1 mL稀釋液放入平板中，用無菌玻璃刮刀將接種物均勻的涂布開。將平板倒置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h計數(shù)一次，直到菌落數(shù)不再增加。根據公式：每克干土中菌數(shù)(個/g)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/(1-土壤含水量)，計算每克干土中的微生物數(shù)量。④純化。將每個土層長出的菌落根據顏色，透明度等外部特征進行篩選，將不同的菌落分別挑取少許細胞接種分離培養(yǎng)，直到長出單個菌落，此時轉接到已制備好的裝有培養(yǎng)基的試管中，待菌落完全長好后放在冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫?1-14］。

土壤營養(yǎng)元素的測定：①有機質質量分數(shù)測定采用油浴外加熱—重鉻酸鉀法。②有效氮質量分數(shù)測定采用康氏皿堿解擴散法。③有效磷質量分數(shù)測定采用硫酸—鹽酸浸提—鉬銻抗比色法。④有效鉀質量分數(shù)測定采用1N醋酸銨浸提—ICP-AES(TJA)法測定［15］。

細菌DNA提取、16SrDNA的PCR及酶切：將3種林齡的土壤中提取的43個細菌接種到裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(不加瓊脂)的試管中，待渾濁度達到0.7左右進行細菌DNA的提取，細菌DNA的提取按照試劑盒中的步驟進行，提取出的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。PCR反應時的條件，95℃預變5 min，30個循環(huán)為95℃變性3 min，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，最后72℃下終延伸10 min。擴增后的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。擴增后的PCR產物選用 Hin fⅠ、HaeⅢ、Hin dⅢ3種酶進行酶切，Hin dⅢ和HaeⅢ一起進行酶切。酶切體系的條件，16S rDNA PCR產物10.0 μL，水16.0 μL，10 ×Buffer R 2.0 μL，Hin dⅢ 1.5μL，HaeⅢ 1.5μL;Hin fⅠ酶切體系的條件，16SrDNA PCR 產物 10.0 μL，水16.5 μL，10 × Buffer R 2.0 μL，Hin fⅠ1.5 μL，均在 37℃的水浴鍋中酶切12 h。再用1.5%瓊脂糖凝膠90 V電壓電泳 1.5 h，檢測條帶并拍照［16-19］。

統(tǒng)計分析：細菌數(shù)量的計算用Microsoft Excel 2003處理，雙因素方差分析和二元變量的相關性分析采用Spss17.0處理，類群的聚類在MVSP軟件上進行［20-21］。

3 結果與分析

3.1 土壤細菌的數(shù)量分布

由表2可知，細菌數(shù)量在3種林齡間的差異顯著(p＜0.05)，1～10年生的麻瘋樹細菌數(shù)量在各土層中均最多，21～30年生的麻瘋樹細菌數(shù)量在各土層中均最少。細菌數(shù)量在土壤表層、0＜土壤深度d≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm之間差異不顯著(p＞0.05)，土壤表層、0 ＜ 土壤深度(d)≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm 與5 cm ＜d≤10 cm、10 cm ＜d≤15 cm、15 cm＜d≤20 cm、20 cm＜d≤30 cm之間差異顯著(p＜0.05)，3種林齡中均表現(xiàn)為15 cm細菌數(shù)量最多，30 cm細菌數(shù)量最少。

表2 不同林齡麻瘋樹土壤細菌數(shù)量 107個·g-1

3.2 土壤細菌的類群組成

對從3個麻瘋樹林齡中提取出的土壤細菌43個類群擴增后的16SrDNA進行酶切(見圖1，圖2)。首先把電泳圖譜的帶型轉換成0、1數(shù)據，用MVSP軟件進行聚類分析。通過聚類分析表明(圖3)，在相似系數(shù)100%時，3塊樣地中提取的43種細菌歸屬于37個類群。1～10年生的麻瘋樹林地有24 個類群，分別為 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、19、21、24、25、26、27、28、31、32、35、36、39、41、42 號菌。11～20 年生的麻瘋樹林地有22 個類群，分別為 1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、15、16、19、21、24、28、32、35、37、41、43 號菌。21～30 年生麻瘋樹林地有 18 個類群，分別為 1、3、5、6、9、10、11、12、15、19、21、24、26、27、28、31、32、35 號菌。可見，隨著林齡的增加，類群數(shù)越來越少，菌類組成也發(fā)生了改變。

3.3 土壤營養(yǎng)元素與細菌數(shù)量的關系

對不同林齡麻瘋樹林地土壤細菌數(shù)量與土壤營養(yǎng)元素進行二元相關性分析的結果表明，細菌與全鉀、有效氮、有效鉀、有效磷呈極顯著性正相關，與全氮呈顯著性正相關，與全磷相關性不顯著，與有機質呈極顯著負相關(表3)。

圖1 細菌Hin dⅢ和HaeⅢ酶切電泳圖

圖2 細菌Hin fⅠ酶切電泳圖

圖3 麻瘋樹林地土壤細菌的聚類分析圖

表3 麻瘋樹林地土壤細菌數(shù)量與土壤化學因子之間的相關性

4 結論與討論

土壤細菌數(shù)量分布受當?shù)貧夂驐l件、水份狀況、土壤營養(yǎng)狀況、土壤質地、植被組成和覆蓋度的綜合影響［22］。在不同發(fā)育階段的麻瘋樹林地內，隨著林齡的增加，土壤細菌數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢。這和喬海莉對新疆天然胡楊林土壤微生物多樣性的研究略有不同［23］，可能是因為隨著林齡的增加，郁閉度和植株生物量增加，因此落葉增加，由于葉子里面含有毒性成分［24-25］，可能限制了某些細菌的生長，從而導致細菌數(shù)量下降，但具體抑制作用還有待于進一步研究。

土壤細菌數(shù)量的垂直分布也存在一定差異，通過方差分析可知，土壤深度對細菌數(shù)量影響顯著，在10 cm＜d≤15 cm處分布較多，15 cm＜d≤20 cm處開始減少。20 cm土層以下雖然富含植物根系，但卻蘊涵大量石塊，土壤密度逐漸增大，孔隙度較小，因此細菌隨土壤深度增加而逐漸減少。細菌多分布在5 cm＜d≤15 cm處，這與此處根系分布密集，根系分泌物多，孔隙度高，水分充足，為其提供了豐富的營養(yǎng)和適宜的生存條件關系密切。由于樣地表面土壤干燥及表層根系分布較少，因此表層細菌的數(shù)量比5 cm＜d≤15 cm處的少。

細菌類群數(shù)與土壤肥力及林地健康狀況有密切的關系［22］。各類群數(shù)量越少，使得土壤中營養(yǎng)元素循環(huán)速率和能量流動減弱，土壤生態(tài)環(huán)境變得越不利于細菌的繁殖和植物的生長［26］。本研究中隨著林齡的增加土壤細菌類群組成產生了改變，各類群數(shù)量也呈現(xiàn)減少的趨勢，說明土壤肥力有下降的趨勢及土壤微環(huán)境不穩(wěn)定。

對于該麻瘋樹生態(tài)系統(tǒng)，影響土壤細菌數(shù)量的土壤營養(yǎng)元素中，細菌數(shù)量與全鉀、有效氮、有效鉀、有效磷呈極顯著性正相關，與全氮呈顯著性正相關，因此全鉀、全氮、有效氮、有效鉀、有效磷在影響細菌的生長發(fā)育中起著重要作用，所以在以后的土壤管理中應加強這幾種營養(yǎng)元素的補充;全磷的影響較小，由于3個林齡中全磷能夠滿足細菌的生長，因此相對其他因子相關性不顯著，但還需要進一步研究，并且宜放大時間尺度和研究對象的范圍;與有機質呈極顯著負相關，有機質主要來源于麻瘋樹的枯枝落葉，因為枯枝落葉中含有有毒成分，可能產生化感作用，抑制細菌的生長，這還有待于進一步研究。

［1］郭瑞英，陳清，李曉林.土壤微生物：抑病性與土壤健康［J］.中國蔬菜，2005(增刊)：78-82.

［2］吳建峰，林先貴.土壤微生物在促進植物生長方面的作用［J］.土壤，2003(1)：18-21.

［3］張鼎華，陳由強.森林土壤酶與土壤肥力［J］.林業(yè)科技通訊，1987，1(4)：1-3.

［4］焦如珍，楊承棟，屠星南，等.杉木人工林不同發(fā)育階段林下植被、土壤微生物、酶活性及養(yǎng)分的變化［J］.林業(yè)科學研究，1997，10(4)：373-379.

［5］薛立，陳紅躍，畢鴻雁，等.馬占相思純林及柚木純林土壤養(yǎng)分、微生物和酶活性的研究［J］.華南農業(yè)大學學報：自然科學版，2002，23(2)：93.

［6］閻德仁，劉永軍，王保祥，等.落葉松人工林土壤微生物含量的研究［J］.內蒙古林業(yè)科技，1995，5(7)：28-33.

［7］張晶，張惠文，李新宇，等.土壤微生物生態(tài)過程與微生物功能基因多樣性［J］.應用生態(tài)學報，2006，17(6)：1129-1132.

［8］徐麗華，婁愷，張華，等.微生物資源學［M］.2版.北京：科學出版社，2010.

［9］Grimont F，Grimont P A D.Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools［J］.Annales de l’Institut Pasteur Microbiologie，1986，137(1)：165-175.

［10］中國科學院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法［M］.北京：科學出版社，1985.

［11］陳仁華.武夷山不同森林類型土壤微生物分布狀況的研究［J］.福建農林科技，2004，31(4)：44-47.

［12］馮健，張健，梁劍.巨桉人工林地土壤微生物類群的初步研究［J］.四川農業(yè)大學學報，2005，23(3)：300-304.

［13］劉子雄，朱天輝，張健.兩種不同退耕還林模式下的土壤微生物特性研究［J］.水土保持學報，2006，20(3)：132-135，149.

［14］羅明，單娜娜，文啟凱，等.幾種固沙植物根際土壤微生物特性研究［J］.應用與環(huán)境生物學報，2002，8(6)：618-622.

［15］國家標準局.中華人民共和國國家標準：森林土壤分析［M］.北京：中國標準出版社，1988.

［16］Gurtler V，Wilson V A，Mayall B C.Classification of medically important clostridia using restriction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rDNA［J］.J Gen Microbiol，1991，137(11)：2673-2679.

［17］Heyndrickx M，Vauterin L，Vandamme P，et al.Applicability of combined amplified ribosome DNA restriction analysis(ARDRA)patterns in bacterial phylogeny and taxonomy［J］.Journal of Microbiological Methods，1996，26(3)：247-259.

［18］Laguerre G，Allard M R，Revoy F，et al.Rapid identification of rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of pcr-amlified 16s rrna genes［J］.Applied And Environmental Microbiology，1994，60(1)：56-63.

［19］Vaneechoutte M，Rossau R，de Vos P，et al.Rapid identification of bacteria of the comamonadaceae with amplified ribosomal DNA-restriction analysis(ARDRA)［J］.FEMSMicrobiol Lett，1992，72(3)：227-234.

［20］郝黎仁，樊元，郝哲歐，等.SPSS實用統(tǒng)計分析［M］.北京：中國水利水電出版社，2002.

［21］Charles Romesburg H.Cluster Analysis for researchers，Lifetime Learning Publications［M］.Belmont：［s.n ］，1984.

［22］Díaz-Ravi?a M，Acea M J，Carballas T.Seasonal changes in microbial biomass and nutrient flush in forest soils［J］.Biology and Fertility of Soils，1995，19：220-226.

［23］喬海莉，田呈明，駱有慶，等.新疆天然胡楊林土壤微生物多樣性的研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2007，29(5)：127-131.

［24］谷勇，曹亞首，殷瑤.小桐子栽培技術研究及應用［J］.世界林業(yè)研究，2008，21(特刊)：78-81.

［25］劉永紅.小桐子的利用價值與栽培技術［J］.經濟林研究，2006，24(4)：74-76.

［26］丁玲玲，祁彪，尚占環(huán)，等.東祁連山不同高寒草地型土壤微生物數(shù)量分布特征研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26(6)：2104-2111.