王 棟 吳瑞紅 程立新 李朋飛 王明月 李 賓 王晨光 郭 政*

1(電子科技大學(xué)生命學(xué)院，成都 610054)

2(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150086)

引言

異常的DNA甲基化與癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]，因此在全基因組范圍內(nèi)識(shí)別癌相關(guān)的差異甲基化基因可以分析疾病發(fā)生的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)用于疾病診斷與藥物靶設(shè)計(jì)的生物學(xué)標(biāo)志[3]。然而，利用甲基化芯片檢測的高通量數(shù)據(jù)往往受諸如試劑與檢測批次、不同操作者等多種因素的影響[4-5]。通常認(rèn)為，這些技術(shù)變異可能降低檢測生物信號(hào)的統(tǒng)計(jì)效能[6]。為了排除這些技術(shù)變異的影響，針對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)處理開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)化方法(如分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化[7]和中值標(biāo)準(zhǔn)化[8]等)常被應(yīng)用于處理甲基化譜數(shù)據(jù)。這些標(biāo)準(zhǔn)化方法將所有樣本的信號(hào)值都標(biāo)準(zhǔn)化到相同的分布，或者使之具有相同的中值，為此通常需要假設(shè)在疾病樣本中差異表達(dá)的基因很少，并且差異高表達(dá)和低表達(dá)的基因數(shù)目大致相等[5]。然而，最近的研究顯示，在癌表達(dá)譜中包含大量上調(diào)表達(dá)的基因。采用這些傳統(tǒng)假設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，會(huì)失查很多與癌相關(guān)的上調(diào)差異表達(dá)基因，并且發(fā)現(xiàn)很多假的下調(diào)差異表達(dá)基因[9]，因此需要采用不依賴于如前所述假設(shè)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，如最小變化集(least variant set，LVS)等[10]。通過分析低通量癌基因組甲基化譜數(shù)據(jù)，有研究者認(rèn)為癌基因組呈現(xiàn)廣泛的低甲基化狀態(tài)[11-12]，因此在癌樣本和正常樣本中的甲基化信號(hào)歸一化的標(biāo)準(zhǔn)化方法可能會(huì)扭曲真實(shí)的生物學(xué)信號(hào)。對此問題，研究者并未達(dá)成共識(shí)。一些研究人員在分析DNA甲基化譜數(shù)據(jù)時(shí)選擇不進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[13-14]，而大部分研究者仍然采用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)化方法對甲基化譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理[15-16]。不同的處理方法可能對篩選差異甲基化基因等后續(xù)分析有重要的影響，有必要進(jìn)行全面的評(píng)估。

在本研究中，通過分析4種癌型的各2套甲基化譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)癌樣本與正常樣本的原始信號(hào)值(beta值)的中值無顯著差異?；谠夹盘?hào)值和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后信號(hào)值篩選出來的差異甲基化基因交疊比例很高，并且改變方向(高甲基化或低甲基化)的高度一致?；诜治粩?shù)標(biāo)準(zhǔn)化后信號(hào)值可以篩選出更多的差異甲基化基因，而且這些基因的改變方向與其對應(yīng)原始信號(hào)的改變方向高度一致，提示采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化可以提高識(shí)別差異甲基化基因的統(tǒng)計(jì)效能，且并未對甲基化數(shù)據(jù)造成嚴(yán)重的偏倚。此外，由同一種癌型的不同數(shù)據(jù)集得到的差異甲基化基因，其改變方向呈現(xiàn)高度的一致性，提示利用甲基化譜可以可靠地發(fā)現(xiàn)癌癥中甲基化的改變方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)

本研究所用數(shù)據(jù)來自高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)[17]和癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)[18]，如表1所示。所有的數(shù)據(jù)都產(chǎn)生自 Illumina HumanMethylation27 BeadChip平臺(tái)。去除性染色體上的位點(diǎn)后，共包括26486個(gè)位點(diǎn)，涉及13890個(gè)基因。對于來自癌癥基因組圖譜中的數(shù)據(jù)集，使用了該數(shù)據(jù)庫中定義的 Level2數(shù)據(jù)，包含探針甲基化(M)與非甲基化(U)信號(hào)強(qiáng)度值、探針與基因的對應(yīng)關(guān)系。甲基化程度Beta值的計(jì)算采用Beta=M/(U+M+100)[14]。

由于甲基化譜中的數(shù)據(jù)可能受到不同批次和不同實(shí)驗(yàn)室等因素的影響[4]，本研究采取如下的標(biāo)準(zhǔn)選取數(shù)據(jù)集：選擇包含不少于10對(癌及癌旁正常組織的配對)樣本的數(shù)據(jù)集，每個(gè)數(shù)據(jù)集中的全部癌癥與正常配對樣本來自同一個(gè)批次及同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，對每個(gè)癌型選取兩個(gè)具有最大樣本量的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集采用如下的命名規(guī)則：癌型(配對樣本數(shù))。通過篩選，最終采用了結(jié)腸癌、肺癌、腎癌和胃癌的甲基化數(shù)據(jù) (見表1)。

表1 4種癌型的甲基化數(shù)據(jù)Tab.1 The methylation datasets for four cancer types

1.2 分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化算法

分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化算法的目的，是使所有樣本中探針強(qiáng)度的分布具有一致的分位數(shù)[7]。假設(shè)有 M張芯片(樣本)，每張芯片上有 N個(gè)探針，則構(gòu)造一個(gè)N×M維的探針強(qiáng)度矩陣E，通過將矩陣的每個(gè)列向量按大小排秩，得到矩陣E1。然后，對E1的每行取均值，得到參考向量。最后，將參考向量中的探針表達(dá)值對應(yīng)到E中每個(gè)列向量的原有秩次上，這樣所有樣本中的探針強(qiáng)度就保持了一致的分布[7]。如圖1所示，原始數(shù)據(jù)中不同樣本間整體甲基化水平波動(dòng)較大，通過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，可以使不同樣本間高通量甲基化數(shù)據(jù)信號(hào)更加一致。通常認(rèn)為，如此標(biāo)準(zhǔn)化后，可以消除技術(shù)變異對高通量甲基化數(shù)據(jù)所帶來的影響，使得數(shù)據(jù)具有較好的可比性。

有研究顯示，分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化算法能夠獲得與其他復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化算法相同甚至更好的效果[19];又由于其計(jì)算簡單，因而被廣泛采用。值得注意的是，由于在高通量芯片數(shù)據(jù)中復(fù)雜的技術(shù)噪聲難以準(zhǔn)確估計(jì)[19]，對標(biāo)準(zhǔn)化算法的評(píng)價(jià)通常只是經(jīng)驗(yàn)性的，而并不能夠根據(jù)其數(shù)學(xué)原理做簡單的解釋。

圖1 甲基化數(shù)據(jù)。(a)標(biāo)準(zhǔn)化前;(b)標(biāo)準(zhǔn)化后Fig.1 The methylation datasets before.(a)and after;(b)normalization

1.3 預(yù)處理與差異甲基化基因的篩選方法

每套數(shù)據(jù)都采用兩種處理方法：一是對樣本進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，使beta值在所有的樣本間都具有相同的分布[7];二是不對 beta值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對于有多個(gè)甲基化檢測位點(diǎn)的基因，保留所有檢測位點(diǎn)具有一致的甲基化改變方向的基因。對每種癌型的兩套數(shù)據(jù)，只將其中篩選出來的基因交集作為后續(xù)分析。

采用配對 t檢驗(yàn)識(shí)別差異甲基化基因，并用Benjamini-Hochberg方法來控制多重檢驗(yàn)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[20]。

1.4 一致性分析

對于得到的兩個(gè)差異基因列表，采用基因重合比例(percentage of overlapping genes，POG)指標(biāo)，評(píng)價(jià)兩個(gè)癌基因列表的一致性[21]。如果長度為 L1的列表1與長度為L2的列表2有k個(gè)交疊的基因，那么從列表1到列表2方向的基因重合比例得分為k/L1，即POG12=k/L1，從列表2到列表1方向的基因重合比例得分為k/L2，即POG21=k/L2。同時(shí)，還計(jì)算了列表1中的差異甲基化基因在列表2中的方向改變一致的比例(P1)，列表2中找到的差異甲基化基因在列表1中方向改變一致的比例(P2)。采用伯努利(Bernoulli)檢驗(yàn)，判斷一致性得分顯著性水平。

對采用同一種方法在同一種癌型的不同數(shù)據(jù)集中選擇的差異甲基化基因列表，采用同樣的方法來評(píng)價(jià)其改變方向的一致性得分及其顯著性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)化對甲基化數(shù)據(jù)信號(hào)的影響

在每套數(shù)據(jù)集中，首先對每個(gè)樣本取其所有檢測位點(diǎn)的原始 beta值的中值，然后利用配對秩和(wilcoxon ranksum)檢驗(yàn)分析正常樣本和癌癥樣本的beta值的中值有無顯著差別。在這8套數(shù)據(jù)中，均未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P＞0.05)?？刂棋e(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)為 0.01，采用配對 t檢驗(yàn)，在每套數(shù)據(jù)中篩選差異甲基化基因;再使用基因重合比例指標(biāo)，評(píng)估采用原始數(shù)據(jù)和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因的一致性。結(jié)果顯示(見表 2)，在各數(shù)據(jù)集中，POG12的指標(biāo)為 80% ～96%，即有80% ～96%的由采用原始數(shù)據(jù)篩選出來的差異甲基化基因包括在由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因中。例如，在 kidney100數(shù)據(jù)中，采用原始數(shù)據(jù)篩選到了3274個(gè)差異甲基化基因，其中有2992(89%)個(gè)包括在由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的3451個(gè)差異甲基化基因中，并且這些共同篩選到的2992個(gè)基因在標(biāo)準(zhǔn)化前后的甲基化改變方向相同。但是，在各數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)中篩選出來的差異甲基化基因中，有4% ～20%的基因沒有在分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中被篩選出來。因此，雖然正常和癌樣本的beta值的中值差別不顯著，但是數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化過程仍然可能會(huì)影響部分基因的顯著性判斷，在減少技術(shù)變異的同時(shí)也可能增加一定的偏倚[22]。

POG21指標(biāo)為72% ～88%，反映在各數(shù)據(jù)集中有12～28%的采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出來的差異甲基化基因，沒有在原始數(shù)據(jù)中篩選出來。為了分析在一套數(shù)據(jù)中由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)單獨(dú)篩選出來的差異甲基化基因是否確實(shí)為反映癌與正常樣本差異的生物學(xué)有效信號(hào)，分析這些基因在關(guān)于同種癌型另外一套獨(dú)立非數(shù)據(jù)集中原始信號(hào)的改變方向。假設(shè)如果這些被判斷為差異甲基化的基因其實(shí)是與疾病狀態(tài)無關(guān)的隨機(jī)錯(cuò)誤，則它們的差異改變方向?qū)⒉粫?huì)在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中被保留下來。分析結(jié)果顯示：對各癌型，在一套數(shù)據(jù)中由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)單獨(dú)篩選出來的差異甲基化基因，在另外一套數(shù)據(jù)中原始信號(hào)改變方向的一致性為80% ～99%(見表3)，均顯著高于隨機(jī)期望值50%(伯努利檢驗(yàn)，P＜0.001)。例如，在 kidney100數(shù)據(jù)中，采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)單獨(dú)找到529個(gè)差異甲基化基因，其中的470(89%)個(gè)基因的改變方向在kidney78數(shù)據(jù)的原始數(shù)據(jù)中得到驗(yàn)證，顯著高于隨機(jī)期望(伯努利檢驗(yàn)，P＜0.001)(見表3)。因此，大部分在各套數(shù)據(jù)中采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化，確實(shí)為反映癌與正常樣本差異的生物學(xué)有效信號(hào)。

在各套數(shù)據(jù)中，采用原始數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因數(shù)目，都少于采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因，提示在原始數(shù)據(jù)中篩選差異基因的統(tǒng)計(jì)效能可能較低。例如，TUSC2(tumor suppressor candidate 2)和TUSC3(tumor suppressor candidate 3)在兩套腎癌的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中，均被判斷為差異高甲基化基因，而采用原始數(shù)據(jù)分析均未能夠?qū)⑦@兩個(gè)基因判斷為差異甲基化基因。已經(jīng)有研究證實(shí)，TUSC2和 TUSC3均為抑癌基因，它們的高表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而高甲基化狀態(tài)可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展[23-24]。再如，WIF1(WNT inhibitory factor 1)在兩套腎癌的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中，均被判斷為差異高甲基化基因;而采用原始數(shù)據(jù)分析均未將這個(gè)基因判斷為差異甲基化基因。已有研究證實(shí)，WIF1的高表達(dá)可以抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用;而在高甲基化狀態(tài)時(shí)，則不能發(fā)揮抑癌作用[25-26]。

采用原始數(shù)據(jù)和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分別篩選出差異甲基化基因，其改變方向具有高度的一致性，P1和P2指標(biāo)為99% ～100%(見表2)。例如，在胃癌的兩套數(shù)據(jù)中，采用原始數(shù)據(jù)和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，分別篩選出的差異表達(dá)基因的改變方向完全一致。

表2 在標(biāo)準(zhǔn)化與非標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中篩選的差異甲基化基因改變方向的一致性Tab.2 The consistency of methylation states of DM genes separately selected from the normalized and non-normalized data

表3 由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化額外篩選出的差異基因在獨(dú)立數(shù)據(jù)中甲基化狀態(tài)的一致性Tab.3 The consistency of methylation states of DM genes solely selected by the Quantile method in one dataset with their methylation states in another independent data

但是，值得注意的是，在結(jié)腸癌、肺癌和腎癌中，在經(jīng)過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因中，約有1%基因的甲基化狀態(tài)與原始數(shù)據(jù)中信號(hào)的改變方向相反。因此，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化過程也可能會(huì)出現(xiàn)一定的過標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)象，從而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。

2.2 差異甲基化基因識(shí)別的可重復(fù)性

由于大部分由采用原始數(shù)據(jù)篩選出來的差異甲基化基因包括在由分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)篩選出的差異甲基化基因的列表中，所以只評(píng)價(jià)采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理識(shí)別差異甲基化基因的可重復(fù)性。對每種癌型的兩套數(shù)據(jù)分別采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，所獲得的差異甲基化基因的甲基化改變方向高度一致(見表4)。例如，在腎癌兩套數(shù)據(jù)中，都被識(shí)別為差異甲基化的2876個(gè)基因的甲基化改變方向全部相同(伯努利檢驗(yàn)，P＜0.001)。另外，95%以上的僅在一套數(shù)據(jù)中找到的差異甲基化基因在另一套數(shù)據(jù)中有相同的改變方向，反映這些基因在另一套數(shù)據(jù)中存在著有效的生物信號(hào)。例如，有575個(gè)基因僅在kidney100數(shù)據(jù)中被判斷為差異甲基化基因，但是其中的567個(gè)(99%)基因在kidney78數(shù)據(jù)中具有相同的甲基化改變方向，顯著高于隨機(jī)期望(伯努利檢驗(yàn)，P ＜0.001)。

因此，在關(guān)于一種癌型的不同的高通量數(shù)據(jù)集中，識(shí)別的差異甲基化基因有高度的可重復(fù)性。這個(gè)結(jié)果也提示，在小樣本數(shù)據(jù)中找到的差異甲基化基因相對少的原因可能是：由于嚴(yán)格的控制多重檢驗(yàn)假陽性的統(tǒng)計(jì)過程，降低了識(shí)別差異甲基化基因的統(tǒng)計(jì)效能[21，27]。

3 討論與結(jié)論

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，是利用基因甲基化譜識(shí)別差異甲基化基因等后續(xù)分析的基礎(chǔ)。在分析低通量癌基因組甲基化數(shù)據(jù)時(shí)，一些研究者發(fā)現(xiàn)癌基因組呈現(xiàn)廣泛的低甲基化現(xiàn)象[12]，因此認(rèn)為傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化方法可能會(huì)扭曲真實(shí)的甲基化信號(hào)[28]。然而，低通量甲基化譜數(shù)據(jù)并不一定能夠準(zhǔn)確反映全基因組的甲基化特點(diǎn)，可能會(huì)產(chǎn)生偏倚。通過分析關(guān)于4種癌型的各兩套高通量全基因組的甲基化譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在癌癥和正常樣本中，探針信號(hào)的中值分布并沒有顯著的差別，提示癌癥和正常樣本的基因組整體甲基化狀態(tài)并無顯著差別。另外，由于存在檢測變異(噪聲)，采用原始數(shù)據(jù)篩選差異甲基化基因的統(tǒng)計(jì)效能可能會(huì)降低，從而會(huì)導(dǎo)致許多差異甲基化基因不能被篩選出來，而經(jīng)過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后可以篩選出更多的差異甲基化基因。值得強(qiáng)調(diào)的是，在一套數(shù)據(jù)集中，經(jīng)過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后額外找到的差異甲基化基因，與在同種癌型的獨(dú)立數(shù)據(jù)集中的原始信號(hào)的改變方向有高度的一致性，具有顯著的非隨機(jī)性，反映了這些差異甲基化基因在獨(dú)立數(shù)據(jù)中存在著明確的生物信號(hào)。這些結(jié)果說明，采用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，可以提高識(shí)別差異甲基化基因的統(tǒng)計(jì)效能。因此，在正常樣本和癌癥樣本中，對于信號(hào)值的中值無顯著差別的甲基化譜數(shù)據(jù)，建議采用針對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)處理開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)化方法。但是，在結(jié)腸癌、肺癌和腎癌中，發(fā)現(xiàn)有1%經(jīng)過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后篩選出的差異甲基化基因，其甲基化狀態(tài)與原始數(shù)據(jù)中信號(hào)的改變方向相反。因此，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化過程也可能會(huì)產(chǎn)生過標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致產(chǎn)生1%左右的假陽性結(jié)果，需要將其去除。

分析也顯示，許多基因僅在研究同種癌型的一套數(shù)據(jù)中發(fā)生了顯著的甲基化改變，而未能夠在另外一套數(shù)據(jù)集中被識(shí)別為差異甲基化。這種表面的低重復(fù)性，可能來源于甲基化變化在個(gè)體間的生物學(xué)變異與異質(zhì)性、嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)控制與較小的樣本量所產(chǎn)生的低統(tǒng)計(jì)效能等因素[21，27]。特別地，在癌基因組中，異常的DNA甲基化改變可以被當(dāng)作生物標(biāo)記，用來預(yù)測癌癥后果和尋找藥物靶點(diǎn)[3];而統(tǒng)計(jì)效能的下降，會(huì)導(dǎo)致在不同數(shù)據(jù)中選擇少數(shù)最顯著的基因作為標(biāo)記變得很不穩(wěn)定[29]。為了評(píng)價(jià)來自研究同種癌型的不同實(shí)驗(yàn)所識(shí)別的最顯著的差異甲基化基因的可重復(fù)性，有必要考慮它們的功能相關(guān)關(guān)系，以及甲基化改變方向的一致性，而不是簡單地計(jì)算它們本身的重合率[30]。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的缺陷如實(shí)驗(yàn)中存在批次效應(yīng)(即與生物學(xué)無關(guān)因素的變異和樣本類別顯著相關(guān))，很可能會(huì)導(dǎo)致不可靠的生物學(xué)結(jié)論[4]。例如，在錯(cuò)誤地整合存在批次效應(yīng)的不同批次的甲基化數(shù)據(jù)時(shí)，很可能會(huì)錯(cuò)誤地判斷差異甲基化基因的改變方向[4]。因此，應(yīng)該更加注重優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，嚴(yán)格地使技術(shù)變異隨機(jī)分布在不同的生物組中，并且在各組中檢測足夠多的樣本[31]。

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