陳慶梅 肖麗丹 李 蓉 張 威 劉清君 王 平*

1(浙江大學(xué) 生物傳感器國家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物醫(yī)學(xué)工程系，杭州 310027)

2(江西中醫(yī)學(xué)院 醫(yī)療電子學(xué)科組，南昌 330006)

引言

嗅覺引導(dǎo)著動物及人類的許多有意義的行為，比如對事物進(jìn)行識別和分類[1]、促使記憶存儲和恢復(fù)[2-3]以及影響兩性的[4]、父母的[5]及社會的[6]關(guān)系等。在哺乳動物嗅覺系統(tǒng)中，嗅球(olfactory bulb，OB)是嗅覺通路的第一中轉(zhuǎn)站，負(fù)責(zé)嗅覺信息的處理并將信息從感覺器官傳遞至中樞靶系統(tǒng)[7-9]。哺乳動物的嗅球呈片狀結(jié)構(gòu)，其水平切片具有清晰的層次結(jié)構(gòu)。嗅球內(nèi)含多種類型的細(xì)胞，如僧帽細(xì)胞(mitral cells，MCs)、叢狀細(xì)胞(tufted cells，TCs)、顆粒細(xì)胞(granule cells，GCs)、球周細(xì)胞(periglomular cells，PGs)等[7，10-12]。不同的嗅球神經(jīng)元表現(xiàn)出不同的生理功能[7，12]。僧帽細(xì)胞和叢狀細(xì)胞通過突觸小球內(nèi)的突觸傳遞獲得來自嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neuron，ORN)的信息[10]，并作為輸出單元將處理后的信號傳遞到更高級的中樞[13-15]。而顆粒細(xì)胞和球周細(xì)胞屬于中間神經(jīng)元，在嗅覺信息處理中具有重要作用[15-17]。因此考察嗅球神經(jīng)元不同的電生理特性，對開展嗅覺信息在嗅球內(nèi)處理和傳遞的研究具有重要的意義。

為了便于鏡下觀察，基于細(xì)胞培養(yǎng)的嗅球神經(jīng)元是主要的實(shí)驗(yàn)對象之一。目前對離體嗅球神經(jīng)元的電信號檢測主要是膜片鉗記錄技術(shù)。隨著微電子機(jī)械加工技術(shù)(MEMS)的發(fā)展，微電極陣列(microelectrode array，MEA)、光尋址電位傳感器(light addressable potentiometric sensor，LAPS)和 場效應(yīng)晶體管(field effect transistor，F(xiàn)ET)等微傳感技術(shù)在生物信號檢測中得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。Liu等[18]曾經(jīng)將嗅球神經(jīng)元培養(yǎng)在 LAPS芯片上觀察氣味對僧帽細(xì)胞有無響應(yīng)，作為研究嗅覺受體神經(jīng)元對氣味響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對照。為了進(jìn)一步研究嗅球神經(jīng)元的電生理特性，本研究將利用MEA長時(shí)程、無損、多通道同步測量的特點(diǎn)，將嗅球神經(jīng)元培養(yǎng)在MEA上，實(shí)現(xiàn)對嗅球神經(jīng)元的多方位同步觀察和分析。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 器件準(zhǔn)備

微電極陣列MEA的制作采用標(biāo)準(zhǔn)微電子制作工藝：5吋玻璃基底(厚度500 μm)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)清洗后在表面磁控濺射一層厚度100～500 ?的Cr或Ti-W薄膜作為中間層，然后再濺射厚度為2000～5000 ?的Au薄膜形成電極層;濺射完成后，沉積一層聚酰亞胺或光刻膠作為絕緣層，并通過反應(yīng)離子刻蝕技術(shù)(reactive ionetching，RIE)刻蝕暴露出金電極陣列圖形。將器件固定在PCB座上，利用點(diǎn)焊技術(shù)將器件上的焊點(diǎn)與PCB板上的焊盤用金線連通。然后用生物相容性較好的環(huán)氧樹脂覆蓋焊絲，粘接測試腔，室溫固化，得到如圖1(a)所示的器件。

圖1 器件。(a)封裝的器件;(b)電鍍鉑黑的MEA顯微照片F(xiàn)ig.1 The instrument.(a)encapsulated instrument;(b)micrograph of MEA after being electroplated platinum black

為了降低熱噪聲，提高細(xì)胞胞外信號檢測的信噪比，本實(shí)驗(yàn)對MEA金電極表面電鍍鉑黑顆粒，以增加電極的表面積，降低電極阻抗。電鍍系統(tǒng)采用三電極系統(tǒng)與CHI660 C型電化學(xué)工作站，每個電極的電鍍時(shí)間約45 s。最后得到的MEA顯微圖片如圖1(b)所示，電極直徑為30 μm。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

嗅球細(xì)胞的培養(yǎng)與大多數(shù)神經(jīng)元培養(yǎng)方法相似。將新生SD乳鼠(1～3 d)剪取鼠頭，將其放入酒精中消毒1～2 min后，立即轉(zhuǎn)入盛有磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)的無菌培養(yǎng)皿中。剪開頭皮，撥開顱骨，暴露全腦。輕輕剝離兩側(cè)嗅球，放于另一無菌盛有PBS的培養(yǎng)皿中。輕輕剝?nèi)ケ荒?，然后將嗅球剪? mm3左右的組織塊，加入2 mL 含 10 μg/L 神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的 DMEM(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium)培養(yǎng)液中進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，接種在MEA表面。24 h后全量換液，48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度生長。每3 d換液一次。培養(yǎng)5～7 d后，可以將芯片取出進(jìn)行觀察和測試。

1.3 染色處理

為了更加清楚地觀察嗅球神經(jīng)元的形態(tài)和生長狀態(tài)，信號測試結(jié)束后對細(xì)胞進(jìn)行染色處理。本實(shí)驗(yàn)采用瑞士染色法，染液包括Ⅰ和Ⅱ兩組份，由堿性染料美藍(lán)和酸性染料伊紅分別配制而成。首先將細(xì)胞培養(yǎng)腔內(nèi)的神經(jīng)測試液吸干;然后滴加適量染液Ⅰ于培養(yǎng)腔內(nèi)，保證溶液浸沒細(xì)胞;1 min后將等量的染液Ⅱ滴加入培養(yǎng)腔，保證染液Ⅰ、Ⅱ均勻混合;大約5 min后用清水沖洗數(shù)遍;將培養(yǎng)腔內(nèi)溶液吸干，置于顯微鏡下觀察。

1.4 信號采集與分析

利用多通道放大器(MEDl6，Multichannel systems，GmbH，德國)，本實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn) 16通道的同步記錄，采樣頻率為10 kHz。

為了評估嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的檢測能力，選用嗅球內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究[19]，觀察了 Glu作用前后不同通道嗅球神經(jīng)元的響應(yīng)。Glu溶液由正常神經(jīng)測試液配制而成，最終濃度為200 μM。

信號的統(tǒng)計(jì)分析圖和光柵圖均通過Matlab軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的構(gòu)建

嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器是通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，使嗅球神經(jīng)元與MEA芯片的微電極在多個位置進(jìn)行耦合，形成的一種生物-電子復(fù)合傳感系統(tǒng)。因此，細(xì)胞培養(yǎng)是嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，細(xì)胞的生長狀態(tài)及形成的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的好壞將直接影響細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的檢測效果。圖2為嗅球細(xì)胞在MEA器件上培養(yǎng)7 d后經(jīng)過瑞士染色處理以后的顯微照片。在顯微鏡下可以清晰地觀察到雙極、三極的嗅球神經(jīng)元，以及神經(jīng)元的樹突和軸突。圖2顯示嗅球細(xì)胞在MEA芯片上生長狀態(tài)良好，神經(jīng)元的樹突和軸突按照一定的方向伸長，開始建立聯(lián)系和重新形成網(wǎng)絡(luò)，這為進(jìn)一步的電生理測量奠定了基礎(chǔ)。

在目前的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中還觀察到一些現(xiàn)象，比如細(xì)胞生長不是非常均勻，有的地方細(xì)胞比較密集，有的地方細(xì)胞比較稀疏;細(xì)胞不是完全地生長在微電極上，而是更傾向于生長在MEA芯片的基底上。這些現(xiàn)象可能是表面處理的涂層不均勻引起的。因此，實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步改進(jìn)MEA表面處理的方法并注意操作的細(xì)節(jié)，保證細(xì)胞均勻地生長和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的形成，以提高嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的檢測率和穩(wěn)定性。

圖2 MEA上培養(yǎng)的嗅球神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Olfactory neuron network cultured on MEA

2.2 嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的實(shí)驗(yàn)分析

利用嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器和多通道采集系統(tǒng)，可以同步觀察多點(diǎn)的嗅球神經(jīng)元電生理活動。圖3為來自6個通道的嗅球神經(jīng)元的自發(fā)信號和200 μM Glu作用下的誘發(fā)響應(yīng)。由圖可知，不同通道的嗅球神經(jīng)元響應(yīng)不一致，信號的幅度和頻率不相同，這可能是由于各電極上生長的嗅球神經(jīng)元的類型或數(shù)目不同。比較各通道Glu作用前后的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Glu使各通道神經(jīng)元鋒電位的發(fā)放更加頻繁，對信號的幅度也有增強(qiáng)作用。此外，在自發(fā)信號很弱或者沒有響應(yīng)的通道，Glu刺激后能夠產(chǎn)生誘發(fā)響應(yīng)，有時(shí)甚至?xí)a(chǎn)生比較強(qiáng)的反應(yīng)，如通道6(Ch6)的響應(yīng)。當(dāng)鋒電位發(fā)放頻率足夠大時(shí)會產(chǎn)生一種爆發(fā)(burst)現(xiàn)象，如圖3中Ch3和Ch6的響應(yīng)。結(jié)果表明，Glu對嗅球神經(jīng)元表現(xiàn)出一種興奮作用，在嗅覺信息的處理中具有放大信號的功能。此外，Glu對每個通道神經(jīng)元的發(fā)放頻率和信號幅度的影響也不完全一樣，這可能是由于不同的嗅球神經(jīng)元具有不同的生理功能，因而表現(xiàn)出不同的電生理響應(yīng)。

取Ch3、Ch6中局部信號(方框內(nèi)信號)進(jìn)行放大，得到圖3底部所示的波形。局部放大的信號表現(xiàn)出明顯的振蕩特征。有研究稱，嗅球中僧帽細(xì)胞釋放的Glu使顆粒細(xì)胞產(chǎn)生興奮，而顆粒細(xì)胞釋放的γ-氨基丁酸(GABA)反過來又抑制了僧帽細(xì)胞的響應(yīng)[20]，在僧帽細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間形成一種互惠連接[21-23];這種互惠作用使得嗅球神經(jīng)元信號產(chǎn)生一種快速的同步振蕩[21-22，24]，在氣味的識別中扮演著重要角色[9]。本研究的結(jié)果顯示，Glu的作用使部分通道的信號產(chǎn)生了振蕩，說明Glu可能是氣味識別中的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一。

圖3 Glu作用前后6個通道的嗅球神經(jīng)元響應(yīng)(底部為方框內(nèi)信號的放大)Fig.3 Olfactory bulb neuron responses from 6 channels before and after using Glu(The signals at the bottom are the amplification of the signals in the frames)

為了更加直觀地比較嗅球神經(jīng)元在不同通道的發(fā)放情況，本研究利用Matlab軟件對圖3中的信號進(jìn)行處理，得到對應(yīng)的光柵圖(見圖4(a))和各通道神經(jīng)元鋒電位的平均發(fā)放率(見圖4(b))。通過圖4(a)可以清晰地了解每個通道信號的發(fā)放頻率，并且可以判斷鋒電位和burst產(chǎn)生的時(shí)刻。由圖4(a)可知，Glu作用后信號發(fā)放明顯增加，并且在Ch1、Ch2和 Ch5時(shí)而出現(xiàn)比較密集的鋒發(fā)放，在Ch3和Ch6會集中爆發(fā)鋒電位。對各通道5 min內(nèi)的鋒電位個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到圖4(b)所示的柱狀圖。自發(fā)信號的平均發(fā)放率最大可達(dá)0.5251/s(見Ch3)，即每分鐘發(fā)放約31.5次;Glu作用下發(fā)放率較大，最大達(dá) 1.1251/s，即每分鐘發(fā)放約 67.5次。說明Glu的作用明顯增強(qiáng)了嗅球神經(jīng)元鋒電位的發(fā)放，并促使了鋒電位的爆發(fā)。圖4(b)還顯示，自發(fā)信號的發(fā)放率相對Glu作用下的偏低，而誤差限相對偏大。該結(jié)果表明嗅球神經(jīng)元的自發(fā)信號是隨機(jī)產(chǎn)生的，沒有一定的節(jié)律性;而200 μM Glu的作用一方面增強(qiáng)了嗅球神經(jīng)元的電活動，另一方面對嗅球神經(jīng)元的電活動具有一種調(diào)節(jié)的作用，使嗅球神經(jīng)元鋒電位的發(fā)放有一定的規(guī)律性。

本研究利用嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器我們記錄了不同通道的自發(fā)信號和Glu誘發(fā)的響應(yīng)，并且比較分析了不同通道信號的特點(diǎn)、區(qū)別以及Glu對不同通道響應(yīng)的影響。由于嗅球內(nèi)含有多種類型的神經(jīng)元細(xì)胞，并且不同類型的神經(jīng)元表現(xiàn)出不同的生理功能[7，12]。因此，通過嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器可以研究和探討嗅球神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中可能存在的響應(yīng)模式和特征，以及嗅球神經(jīng)元對嗅覺信息的處理功能和編碼形式。比如，我們可以考察不同條件刺激下不同通道神經(jīng)元的激活情況和響應(yīng)強(qiáng)度，通過反復(fù)訓(xùn)練，找出神經(jīng)元條件刺激下的響應(yīng)規(guī)律，進(jìn)而分析神經(jīng)元的信息處理功能和嗅覺信息的編碼方式。

圖4 圖3中6通道信號的發(fā)放率分析。(a)光柵圖;(b)神經(jīng)元發(fā)放率統(tǒng)計(jì)分布圖Fig.4 Firing rate analysis of signals from 6 channels in Fig.3.(a)raster plot;(b)firing rate distribution

由于受實(shí)驗(yàn)條件的限制，目前的研究還沒有將神經(jīng)元的類型與記錄的信號一一對應(yīng)。因此，在下一步的實(shí)驗(yàn)中，需要考慮電生理檢測與免疫組織化學(xué)的結(jié)合，通過對嗅球神經(jīng)元的特異性標(biāo)記來分辨不同類型嗅球神經(jīng)元的響應(yīng)特點(diǎn)、模式和可能的信息處理功能。

3 結(jié)論

細(xì)胞形態(tài)觀察和電生理的實(shí)驗(yàn)表明，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與MEA芯片結(jié)合，可以構(gòu)造一種離體的嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器。利用該細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器能夠?qū)Χ帱c(diǎn)的嗅球神經(jīng)元電生理活動實(shí)施同步監(jiān)測與分析，可用于分辨不同條件下不同位置的神經(jīng)元響應(yīng)的區(qū)別。該研究對進(jìn)一步分析嗅球神經(jīng)元對嗅覺信息的處理與編碼功能具有重要的意義。

目前，嗅球細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的研究處于起步階段，還需要不斷地改進(jìn)和深入地研究。首先，通過微印章表面處理技術(shù)或改進(jìn)MEA的微結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞定向生長，進(jìn)一步提高細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器的檢測效率和穩(wěn)定性;利用熒光標(biāo)記手段，辨別嗅球神經(jīng)元的類型，便于電生理機(jī)制的探討;與在體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，建立嗅球神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)模型。

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