張麗勍, 許景升, 徐 進, 馮 潔

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193)

病原細菌通常利用蛋白的分泌來介導(dǎo)與寄主植物的相互作用[1]。革蘭氏陰性病原細菌能夠通過精細的裝置將蛋白運送到胞外,或直接運輸?shù)郊闹骷毎?這些精細的裝置稱為分泌系統(tǒng)。目前為止,發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性病原菌中至少存在著6種不同類型的分泌系統(tǒng)(Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng)),這些分泌系統(tǒng)通過分泌或注射的方式釋放胞外蛋白或效應(yīng)子,以刺激或干擾寄主細胞的活動,從而能夠調(diào)控一系列的病原細菌—寄主細胞的相互作用。Ⅰ型分泌系統(tǒng)負責(zé)釋放多種胞外蛋白和胞外酶[2];Ⅱ型分泌系統(tǒng)從病原細菌內(nèi)部分泌蛋白到外部,降解寄主細胞組分[3]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)和Ⅳ型分泌系統(tǒng)注射效應(yīng)子到寄主細胞中[4-5]。Ⅴ型分泌系統(tǒng)具有最簡單的蛋白分泌機制,通常只分泌單一特殊的細菌效應(yīng)子[6]。

其中,Ⅱ和Ⅴ型分泌系統(tǒng)的底物蛋白都需要一個N末端信號肽,以便于利用Sec路徑從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)。相反Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系統(tǒng),它們不需要信號就能泌出蛋白。Ⅱ～Ⅳ型分泌系統(tǒng)是大型的多蛋白復(fù)合體,可以跨越整個細胞膜結(jié)構(gòu)。尤其是Ⅲ和Ⅳ型分泌系統(tǒng)參與了細菌和真核細胞的相互作用及細菌效應(yīng)分子直接輸入到真核細胞質(zhì)的過程。這兩個分泌系統(tǒng)的編碼基因一般分布在大的基因簇中,通常稱為致病島。

1 新型的分泌系統(tǒng)—Ⅵ型分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

2006年,科學(xué)家報道了在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中存在一種新型的分泌系統(tǒng),并將其命名為Ⅵ型分泌系統(tǒng)[1,7]。盡管Ⅵ型分泌系統(tǒng)是在2006年命名的,但是有關(guān)該系統(tǒng)存在的研究可以追溯到十年前。1996年,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),霍亂弧菌中的H cp(haemolysin co-regu lated p rotein),與霍亂弧菌中其他泌出蛋白不同,它的分泌不需要信號肽的剪切過程[8]。1997年,在豌豆根瘤菌(RhizobiuMleguminosarum)中發(fā)現(xiàn)一個對豌豆根瘤具有負調(diào)控作用的染色體位點,后來被命名為imp(impaired in nodulation)位點,即現(xiàn)在的Ⅵ型分泌系統(tǒng)[9]。1998年,Wang等鑒定出在銅綠假單胞菌中的一個編碼絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase STPK)的侵染誘導(dǎo)基因,位于icMF基因下游,其在由銅綠假單胞菌引起的鼠中性白細胞減少癥中具有重要的作用[10]。同年,從嗜肺性軍團桿菌(Legionella pneumophila)染色體中發(fā)現(xiàn)icmGCDJBF基因簇,icmGCDJBF是嗜肺性軍團桿菌icm殺死巨噬細胞所必需的[11]。2000年,來自印度加爾各答的Das等人在研究霍亂弧菌侵染兔回腸模型中,發(fā)現(xiàn)icMF同源物[12]。

該保守的基因簇后來被認為是T6SS座位,開始引起人們的關(guān)注。2002年,Pallen等進行了一項細菌蛋白研究,該細菌蛋白包含F(xiàn)HA(forkhead-associated)結(jié)構(gòu)域,已知與 STPKs的靶標(biāo)可逆結(jié)合[13-14]。他們注意到致病的或共生的革蘭氏陰性細菌具有一個保守性較高的基因簇,該基因簇均含有一個編碼FHA結(jié)構(gòu)域的基因。這些簇中的一些基因同樣可以編碼一個STPK和一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶(serine-threonine protein phosphatase,STPP),從而認為FHA結(jié)構(gòu)域參與了依賴磷酸化作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。同年,Swedish等在傷寒沙門菌(Salmonella enterica)中發(fā)現(xiàn)新的基因組島(Sa lmonellaenterica centisome 7 genoMic island),它與其他的icmF簇相關(guān)聯(lián),研究結(jié)果表明這個島的缺失降低了S.enterica進入真核細胞的能力[15]。

2003年,Das等通過對Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因座位的生物信息學(xué)分析,提供了第一手詳盡的資料[16],他們將T6SS基因簇命名為IAHP(IcMF-associated hoMologous protein)簇,這些基因簇是通過它們是否編碼IcMF同源物來定義的。盡管IcmF與嗜肺性軍團桿菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)有關(guān),但是大多數(shù)被編碼的蛋白與Ⅳ型分泌系統(tǒng)的組成蛋白并不同源。IAHP蛋白在分泌中的作用被接下來的一個研究所證實。該研究表明來自豌豆根瘤菌的iMp基因簇在依賴環(huán)境的蛋白分泌中起作用[17]。2004年和2005年,新加坡Leung研究組的工作表明,魚的病原細菌Edwardisella tarda中的Evp蛋白在其致病過程中起作用,并且推測它們可能是一個新的分泌機制的組成部分[18-19]。到2005年底,Parsons等證明Salmonella的IcMF同系物SciS,具有控制胞內(nèi)細菌水平和削弱毒性的能力[19],而且類似ClpB蛋白(ClpV家族)的一個新的種類已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且證實與細菌-寄主細胞的相互作用有一定的聯(lián)系[20]。

2 Ⅵ型分泌系統(tǒng)與革蘭氏陰性病原菌致病性的關(guān)系

目前關(guān)于T6SS與革蘭氏陰性病原菌致病性的關(guān)系尚無深入的研究,但是T6SS對細菌毒力的影響在許多種類中都已有報道。具有T6SS的細菌均屬于革蘭氏陰性菌的變形菌綱,且多數(shù)存在于有毒種類中。例如,在霍亂弧菌中,無毒力的V.fischeri和V.harvey不含有T6SS基因,而具有毒力的V.parahemoly ticus和 V.fu lvinicus則含有 T6SS基因。T6SS缺失的霍亂弧菌突變體能夠大大減弱細菌細胞對寄主盤基網(wǎng)柄菌(DictyosteliuMdiscoideum)的毒性。相關(guān)試驗表明,Sa lmonella中T6SS的VgrG蛋白在細菌致死作用中起著重要作用[21]。而在愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)中,T6SS分泌系統(tǒng)的組分蛋白EvpP在該菌的侵染過程中,起著至關(guān)重要的作用,并且是減毒活疫苗的潛在靶標(biāo)[22]。土拉弗朗西斯菌(Francisella tu larensis)中,IglA-IglB復(fù)合體的形成(其中iglA和iglB在大多數(shù)T6SSs中是保守的)對于其致病性起關(guān)鍵作用[23]。因此推測T6SS與病原菌的致病性有非常密切的關(guān)系。

3 Ⅵ型分泌系統(tǒng)的作用機制

T6SS編碼基因以基因簇形式存在,該基因簇通常編碼12～25個蛋白,T6SS基因簇在至少16個革蘭氏陰性菌變形菌綱中存在[24]。T6SS的另一個典型特點是其基因簇編碼Ser/Thr激酶和磷酸酶。

3.1 Ⅵ型系統(tǒng)分泌的效應(yīng)子

目前已知,Ⅵ型系統(tǒng)與Ⅲ型和Ⅳ型分泌系統(tǒng)一樣均向外輸出稱為效應(yīng)子的蛋白[25]。這些效應(yīng)子具有調(diào)節(jié)多種細胞功能的作用。效應(yīng)子與細菌毒性因子不同,細菌毒性因子通常具有單一的生化活性,直接在特異性的細胞靶標(biāo)上發(fā)揮作用;而效應(yīng)蛋白則是與通過同一分泌系統(tǒng)的其他的多種細菌效應(yīng)子協(xié)同作用,從而發(fā)揮出特異性的功能[26]。

所有T6SS效應(yīng)分子的直向同源基因均缺乏典型的N末端信號肽[27]。目前,已知H cp(haemolysin co-regu lated p rotein)和VgrG(valine g lycine repeat)蛋白家族是T6SS中的效應(yīng)子。兩者在攜帶有T6SS基因簇細菌的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)[1,28-29]。

依賴T6SS系統(tǒng)分泌的VgrG蛋白首先是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的[7]。所有的VgrG蛋白的源基因均具有一個C末端信號肽。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),VgrG蛋白與T4噬菌體尾突的gp5/gp27蛋白具有相似性,尾突結(jié)構(gòu)是噬菌體用來刺穿細菌的膜結(jié)構(gòu)從而允許噬菌體將DNA注射到細胞內(nèi)。VgrG分子具有雙重功能,既是膜穿刺結(jié)構(gòu)的組成部分,還可以作為效應(yīng)分子起作用。

H cp首先是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的[7],在銅綠假單胞菌中得到再次確認[1],目前在所有具有 T6SS的細菌中均存在H cp。此外,H cp蛋白已經(jīng)被證明在胞外可以形成六聚環(huán)的結(jié)構(gòu)[1],并且推測其能在細菌細胞表面組裝成一個通道,延伸或包圍在VgrG蛋白形成的管道周圍,從而使得其他的效應(yīng)分子可以運輸?shù)郊闹骷毎?/p>

由于分泌蛋白的這些結(jié)構(gòu)特點,推測 T6SS形成了一個穿透寄主細胞膜的通道。

最新的研究驗證了銅綠假單胞菌的3個毒素,包括通過依靠T6SS方式分泌的毒素Tse2[30]。這3個毒素阻擋它們的產(chǎn)物使其不去影響H cp分泌到細胞培養(yǎng)上清液中。目前仍舊缺乏有關(guān)T6SS效應(yīng)子轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)細胞中的直接證據(jù)[31]。然而,銅綠假單胞菌的細胞中含有一個能夠起作用的T6SS,能夠抑制其他Pseudomonas菌株的生長,這種抑制既依賴于 Tse2的作用,又依賴于細胞和細胞之間的聯(lián)系,由此為效應(yīng)子運輸?shù)桨卸毎刑峁┝藦娪辛Φ淖C據(jù)[32]。

3.2 Ⅵ型分泌系統(tǒng)的作用機制

T6SS含有一個來自于AAA+(ATPases associate with various cellular activities),ClpV家族的六聚物-ATPase,通過ATPase的水解作用供能,來完成泌出蛋白的運輸過程。其中,ClpV是H sp100/C lp家族的成員。Hsp100/Clp蛋白具有多聚環(huán)狀的結(jié)構(gòu),能夠通過保守的AAA結(jié)構(gòu)域結(jié)合ATP并且能夠?qū) TP水解來展開靶標(biāo)蛋白。T2SS,T3SS和T4SS的 ATPase組分也形成六聚環(huán),并且與AAA+蛋白具有一致性,由此說明這些ATPase在蛋白分泌中具有保守的結(jié)構(gòu)特點[33-34]。傷寒沙門菌InvC,T3SS的核心ATPase負責(zé)展開來自分子伴侶的分泌蛋白,并可能將這些底物泵入 T3SS針狀結(jié)構(gòu)中(折疊的蛋白不能進入針狀結(jié)構(gòu),只有展開后才可進入)[35]。ClpV對于分泌蛋白H cp和VgrG則沒有顯示出相同的作用,而是與T6SS組分中的2個至關(guān)重要和相對保守的蛋白V ipA和V ipB相互作用[36]。

綜合已有研究報道,通過生物信息學(xué)分析,T6SS的作用機制假說可以歸結(jié)為：T6SS系統(tǒng)最初的活化依靠未知的環(huán)境因子。在細菌感應(yīng)到信號后,具有FHA結(jié)構(gòu)域的Fha同系物通過與絲氨酸-蘇氨酸激酶相互作用引發(fā)了最初的活化。一旦被激活,T6SS設(shè)備的組裝開始,泌出通道由 H cp、VCA 0109和VgrG形成。當(dāng)H cp在跨膜區(qū)域形成一個六聚體泌出通道后,VgrG便在細胞表面形成一個可以到達寄主細胞的尾突狀結(jié)構(gòu),它作為穿刺設(shè)備起作用。VCA 0109從細菌的外膜到寄主膜形成一個通道并且與VgrG的每個單體的gp5結(jié)構(gòu)域相互作用。所有內(nèi)膜蛋白的組裝機制目前尚不清楚。在組裝好所有組分后,作為分子伴侶和ATPase的ClpB,形成一個六聚結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)與Hcp相互作用,通過水解ATP為效應(yīng)子蛋白的運輸提供能量。輔助蛋白VasK和VasF(IcMF蛋白家族)引起細菌細胞表面的重組,導(dǎo)致了對寄主細胞黏附度的增加。VasK同時幫助運輸和信號識別作用,因此可以增加運輸?shù)男?。效?yīng)子蛋白(H cp,VgrG等)在脂蛋白VCA 0113的幫助下,通過由OMpA形成的易位孔運輸至胞外。其中,VCA 0109,屬于溶菌酶家族蛋白,包含一個gp25結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域被認為用于水解寄主細胞壁的肽聚糖殘基——NAG和NAM。VCA 0113是一個功能未知的蛋白,位于霍亂弧菌的T6SS基因簇,具有脂蛋白結(jié)構(gòu)域,參與胞內(nèi)蛋白的運輸和泌出,VCA 0113是 T6SS中僅有的外膜蛋白[31]。

4 植物青枯菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀

植物細菌性青枯病是由茄勞爾氏菌(Ra lstonia solanacearum)引起的一種世界性分布的重大病害。2002法國科學(xué)家Salanoubat等在Nature上報道了青枯細菌(GMI 1000菌株,1號小種)的全基因組序列,是世界上報道的第1例植物病原細菌全基因組序列[37]。

目前有關(guān)茄勞爾氏菌(R.so lanacearum)中T6SS的研究文獻較少,進展不大,因此對茄勞爾氏菌中T6SS的研究顯得更有意義。

通過比對,我們發(fā)現(xiàn)公布的青枯菌基因組序列中也存在與Ⅵ型分泌系統(tǒng)同源的基因簇,同源性達到80%。我們對編碼核心蛋白的8個基因進行了克隆,并完成了這8個基因的重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建,目前已獲得了其中的2株單基因失活突變株。經(jīng)致病性試驗發(fā)現(xiàn),這2株突變株的致病能力較野生型明顯下降[38]。

目前的研究已經(jīng)初步證明Ⅵ型分泌系統(tǒng)的基因簇與青枯菌致病有關(guān)[38],但還有待于更進一步的研究。由于Ⅵ型分泌系統(tǒng)是新近發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng),其結(jié)構(gòu)、功能及泌出蛋白的種類和機制尚不清楚。因此對青枯菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的研究,可能對探究其致病機理具有非常重要的意義。

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