劉亞光, 劉 蕊, 唐廣順
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)
影響降解菌W2修復(fù)異草酮污染土壤的三種因子的優(yōu)化
劉亞光, 劉 蕊, 唐廣順
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)
[目的]確定降解菌W2對(duì)土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復(fù)條件。[方法]采用3因素5水平正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),室外盆栽生物測(cè)定方法,研究降解菌W2接種量、土壤含水量和肥料添加量3種田間可控因子對(duì)降解菌W2修復(fù)異噁草酮污染土壤效果的影響。[結(jié)果]確定修復(fù)條件的優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型為:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,不同因子對(duì)土壤修復(fù)影響大小順序依次為土壤含水量、肥料添加量、降解菌W2接種量。[結(jié)論]降解菌W2對(duì)土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復(fù)條件為:降解菌W2接種量 8.19~11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量18.6%~20.84%,肥料添加量1.83~2.52 g/kg。在此范圍內(nèi)降解菌W2對(duì)異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg的風(fēng)干土壤30 d后的降解率可達(dá)60%以上,可接近該修復(fù)天數(shù)的理論極值65.56%。
異噁草酮; 降解菌W2; 降解率
異噁草酮是20世紀(jì)80年代FMC研制的有機(jī)雜環(huán)類選擇性苗前除草劑,抑制敏感植株葉綠素和類胡蘿卜素的合成,防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草效果顯著[1-3],可廣泛應(yīng)用于大豆、棉花、甘蔗、玉米、煙草等作物田[2,4]。異噁草酮在土壤中的生物活性長(zhǎng)達(dá)16個(gè)月,在水中殘留為130 d以上,自然降解速度緩慢,其長(zhǎng)殘留性不僅對(duì)后茬作物小麥、油菜、甜菜、向日葵以及多種蔬菜產(chǎn)生殘留藥害,亦影響到作物地周?chē)锷L(zhǎng)[5],嚴(yán)重地影響了種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和生態(tài)安全[6]。此類除草劑在土壤中不易發(fā)生光降解和水解,對(duì)土壤微生物和土壤酶活性有促進(jìn)作用[7],其降解主要依靠微生物活動(dòng)[8-9]。
2005年,本課題組從長(zhǎng)期施用異噁草酮的黑土中分離出可高效降解該除草劑的降解菌W2,前期試驗(yàn)得出在異噁草酮濃度500 μ g/kg風(fēng)干土,田間持水量40%的條件下,接種20 mL/kg W2菌后降解半衰期為27.5 d,相比未接種土壤縮短63.9%[10]。該降解菌適應(yīng)力強(qiáng),在溫度20~37℃、pH6.0~9.0范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)異噁草酮的研究主要集中在除草機(jī)制、選擇性機(jī)制、代謝降解機(jī)理、安全性及與其他農(nóng)藥的配合作用等[3,5-6],異噁草酮微生物降解的研究以及對(duì)異噁草酮降解菌應(yīng)用條件的摸索除了本課題組外還未見(jiàn)報(bào)道。影響生物修復(fù)效果的因素主要是被降解農(nóng)藥的種類和濃度、微生物群體的活性和環(huán)境因子[11]。而自然環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜,很多自然因素(溫度、土壤類型等)不可控,優(yōu)化可控因素能夠大幅度提高降解菌的降解效果[12-13]。土壤中的自然微生物無(wú)法迅速有效地降解土壤中污染物的情況下需要進(jìn)行人工接種[14],作用效果顯著[15-16]。接菌量的多少勢(shì)必會(huì)影響該菌群在土壤中的生活力,劉亞光等[17]研究發(fā)現(xiàn)接種量對(duì)降解菌Y1降解土壤中異噁草酮有很大影響。并且,向土壤中添加肥料不僅可以為降解菌提高碳源和能源,也可以促進(jìn)土壤呼吸[18],加快對(duì)異噁草酮的降解,前期試驗(yàn)表明添加無(wú)機(jī)肥料效果好于有機(jī)肥料[12]。而土壤含水量和土壤呼吸呈線性相關(guān)[19],必然會(huì)影響W2菌的降解效果,且水分作為農(nóng)藥運(yùn)輸擴(kuò)散的溶劑對(duì)微生物的降解也有很大影響[20]。
本試驗(yàn)擬對(duì)W2菌做進(jìn)一步應(yīng)用性研究。根據(jù)田間實(shí)際情況,利用生物測(cè)定方法,通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化降解菌接種量、土壤含水量和肥料添加量3種田間可控因素,確定降解菌W2的最優(yōu)生物修復(fù)條件,為異噁草酮降解菌劑應(yīng)用于田間實(shí)際條件,最終解決異噁草酮的后茬危害問(wèn)題,奠定良好的基礎(chǔ)。
降解菌W2(短桿菌屬Brevibacterium),為本課題組從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場(chǎng)長(zhǎng)期施用異噁草酮的試驗(yàn)田中分離出的具有降解異噁草酮作用的需氧型細(xì)菌菌株,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥與雜草教研室提供。培養(yǎng)基:牛肉膏 5 g,蛋白胨5 g,瓊脂 18 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,pH7.0~7.2。
供試藥品:異噁草酮(clomazone)480 g/L乳油,美國(guó)富美實(shí)公司。
供試作物:玉米,品種為‘東農(nóng)250’。
供試儀器:RXZ型智能人工氣候箱,寧波江南儀器廠;超凈工作臺(tái),上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠。
供試土壤:采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊園藝站附近荒地(未施藥)。土壤為黑土,其理化性質(zhì)如下:pH6.75,有機(jī)質(zhì)含量 4.17%,全氮 0.185%,全磷0.546%,堿解氮 1.55 mg/kg,速效氮 0.955 mg/kg,速效鉀2.359 mg/kg。
供試肥料:通用性復(fù)合肥料,總養(yǎng)分含量 ≥45%,N 、P2O5、K2O 的比例為 12∶18∶15,黑龍江倍豐農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料有限公司。
1.3.1 建立異噁草酮含量生物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線
異噁草酮通過(guò)抑制植株體內(nèi)類胡蘿卜素和葉綠素的合成來(lái)抑制光合作用導(dǎo)致植株死亡[2]。本試驗(yàn)采用玉米土培法[21]測(cè)定葉片葉綠素含量,建立土壤中異噁草酮濃度與葉綠素含量抑制率之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。第7天測(cè)葉綠素含量,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。異噁草酮有效成分濃度為 1~50 μ g/kg 時(shí):y=-4.776 4x-0.676 2(R2=0.932 6);有效成分濃度 50 ~ 1 000 μ g/kg時(shí):y=37.063x-172.75(R2=0.972 8)。
1.3.2 異噁草酮降解菌W2最佳修復(fù)條件的研究
3因素5水平正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)因素水平編碼表
降解菌W2濃度為A650=0.4。向風(fēng)干土中添拌異噁草酮,按試驗(yàn)設(shè)計(jì),同時(shí)混拌降解菌、肥料和無(wú)菌水,使土壤中異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg(等同田間有效施用量600 g/hm2)。土壤盆裝(上口徑8 cm×下口徑5.5 cm×高11 cm),上覆保鮮膜,置于溫室中,每2 d測(cè)量土壤濕度并及時(shí)補(bǔ)無(wú)菌水。培養(yǎng) 15、30、45、60、90 d后分別取土樣,參照玉米土培法[21],播種已催芽的玉米,每試驗(yàn)重復(fù)4次,人工氣候箱中光暗交替(12 h∥12 h)培養(yǎng)。第7天測(cè)玉米葉綠素含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土壤中異噁草酮的含量。
1.3.3 數(shù)據(jù)分析
微生物對(duì)異噁草酮的降解率=(初始濃度-處理后殘留濃度)×100%/初始濃度。
應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)系統(tǒng)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,并用origin對(duì)旋轉(zhuǎn)回歸進(jìn)行譜圖分析。
圖1所示,降解菌W2對(duì)異噁草酮的修復(fù)效果在0~90 d內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)修復(fù)的效果越好,90 d時(shí)降解率最高可達(dá)90.41%,且3個(gè)處理之間差異不顯著。處理8與處理1和0水平相比,降解率值雖略低,但降解均呈上升趨勢(shì),且3個(gè)處理在30 d的時(shí)候,降解速度增幅最快,由13.59%、7.01%、27.15%升至 62.93%、41.37%、62.42%,差異顯著。本試驗(yàn)選擇30 d作為修復(fù)時(shí)間,不僅具代表性且有利于試驗(yàn)的展開(kāi)。如表2,以30 d的降解率進(jìn)行回歸分析,建立數(shù)學(xué)模型并對(duì)方程進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn),將回歸模型優(yōu)化為:
試驗(yàn)中各因素貢獻(xiàn)率分別為 ΔC1=0,ΔC2=2.246 667,ΔC3=2.091 225,由此可知 3個(gè)因素對(duì)降解率影響大小順序依次為:土壤含水量、肥料添加量、降解菌接種量。
圖1 降解菌W2對(duì)異噁草酮的降解效果
表2 降解率試驗(yàn)結(jié)果(30 d)
當(dāng)其中2個(gè)因素水平分別都取-1,0,1時(shí),分析第3個(gè)因素與異噁草酮降解率的關(guān)系。以試驗(yàn)因素編碼號(hào)為橫坐標(biāo),以降解率為縱坐標(biāo),降維分析后得曲線如圖2所示。
圖2(a)可以看出,當(dāng)其他2個(gè)因素固定時(shí),W2菌接種量的提高,對(duì)降解效果沒(méi)有明顯的影響。充分說(shuō)明降解菌W2在土壤中的適應(yīng)能力好,生長(zhǎng)繁殖速度快,對(duì)異噁草酮降解效果相差不大。圖2(b、c)可知,適度提高土壤含水量和外源肥料均可促進(jìn)W2菌對(duì)異噁草酮的降解效果,但土壤含水量超過(guò)22.5%、肥料添加量超過(guò)2.5 g/kg,降解效果略有降低。
根據(jù)數(shù)據(jù)繪制土壤含水量(%),肥料添加量(g/kg),接菌量(mL/kg)中雙因素交互作用時(shí)對(duì)降解率(%)影響的曲面圖。如圖3系列所示。
如圖3(a)所示,土壤含水量固定時(shí),適度提高肥料添加量可顯著促進(jìn)W2菌對(duì)異噁草酮的降解,且在土壤含水量為18.75%時(shí)達(dá)最高點(diǎn)。當(dāng)肥料添加量固定于某一水平下時(shí),W2菌對(duì)異噁草酮的降解效果隨著土壤含水量的增加呈先促進(jìn)后抑制。圖3(b)所示,肥料添加量固定,接菌量的多少對(duì)異噁草酮的降解效果影響不明顯,同單因素試驗(yàn)結(jié)果相同;接菌量固定,適度提高肥料用量,降解效果呈明顯上升趨勢(shì)。圖3(c)所示,當(dāng)土壤含水量處于某一水平時(shí),接菌量的增加,變化不明顯;接菌量固定時(shí),適度土壤含水量提高,降解效果可明顯升高。因此,可少量施用降解菌W2,適當(dāng)提高土壤含水量和肥料的用量,即可明顯促進(jìn)對(duì)異噁草酮的降解。
對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化,求出理論極值。
ymax=65.56%,此時(shí)各因素的對(duì)應(yīng)編碼值為(0,0,1),即C1(W2菌接種量)=10 mL/kg,C2(土壤含水量)=18.75%。C3(肥料添加量)=2.5 g/kg。
ymin=14.76%,此時(shí)各因素的對(duì)應(yīng)編碼值為(-1.682,-1.682,-1.682),即C1(W2菌接種量)=1.6 mL/kg,C2(土壤含水量)=12.45%。C3(肥料添加量)=1.16 g/kg。
利用頻數(shù)分析方法尋找最優(yōu)生物修復(fù)條件,其中大于60%的方案共有45個(gè),頻數(shù)分析結(jié)果列于表3。
表3 降解率模型頻數(shù)分析
由表3可知,95%置信區(qū)間30 d后降解率超過(guò)60%的降解條件為接菌量8.19~11.81 mL/kg,土壤含水量18.6%~20.84%,肥料添加量1.83~2.52 g/kg。用45 d的數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,95%置信區(qū)間45 d后降解率超過(guò)71%的降解條件為接菌量8.95~11.09 mL/kg,土壤含水量17.9%~19.56%,肥料添加量1.89~2.11 g/kg,與 30 d回歸模型結(jié)果相符。
試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化可控自然因素來(lái)保證并提高降解菌修復(fù)異噁草酮污染土壤的效果。得到了異噁草酮降解菌W2生物修復(fù)條件的優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,此模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)降解菌W2對(duì)土壤中異噁草酮的降解率。在接種量1.6~18.4 mL/kg,土壤含水量12.45%~25.05%,肥料添加量1.16~2.84 g/kg范圍內(nèi),土壤含水量對(duì)降解率的影響作用最大,其次是外源肥料。土壤含水量在該范圍內(nèi)可保證除草劑在土壤中的運(yùn)輸及與降解菌的接觸幾率;但土壤含水量不能過(guò)高,否則將導(dǎo)致土壤含氧量降低,影響需氧菌W2的呼吸機(jī)制,進(jìn)而影響降解效果。東北土壤含水量年均值22%[22],具冬季最高,夏季次之,春秋偏低的特點(diǎn),可根據(jù)土壤含水量的大小綜合考慮確定施用降解菌的最適時(shí)期。外源肥料的添加不僅可以促進(jìn)土壤呼吸[18],同樣可以促進(jìn)土壤微生物的恢復(fù),提高降解菌對(duì)污染物的降解活性,張超蘭在研究外源物質(zhì)影響土壤微生物對(duì)甲磺隆和莠去津污染土壤的快速降解問(wèn)題得到相同結(jié)論[13]。區(qū)別于其他學(xué)者得出的土壤中農(nóng)藥降解率與接菌量呈正相關(guān)的結(jié)論[15,23],本試驗(yàn)中接菌量的增減與降解率之間的相關(guān)性不明顯,表明W2菌的群體適應(yīng)力強(qiáng),生長(zhǎng)繁殖迅速,可有效降解殘留的異噁草酮,并且需要額外的碳源和能源來(lái)滿足生長(zhǎng),確保降解微生物的持續(xù)繁殖。所以,適度提高土壤含水量和肥料添加量即可顯著促進(jìn)降解菌W2對(duì)異噁草酮的降解效果。
降解菌對(duì)土壤中異噁草酮的最優(yōu)生物修復(fù)條件:降解菌W2接種量 8.19~11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量 18.6%~20.84%,肥料添加量1.83~2.52 g/kg。在此范圍內(nèi)降解菌W2對(duì)異噁草酮有效成分濃度為500 μ g/kg(等同田間有效施用量600 g/hm2)的風(fēng)干土壤30 d后的降解率可達(dá)60%以上,可接近該修復(fù)天數(shù)的理論極值65.56%。修復(fù)90 d后的效果將更好。該菌適應(yīng)能力強(qiáng),在北方偏干的土壤中仍可有效降解異噁草酮。唐廣順[12]在異噁草酮有效成分濃度為700 μ g/kg,土壤含水量18.75%條件下接種10 mL/kg降解菌W2,90 d后玉米生長(zhǎng)接近正常水平。
本研究最終目的是應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,而將降解菌制成微生物肥料不但有利于其在田間傳播,而且菌、肥同時(shí)施用也簡(jiǎn)化了農(nóng)業(yè)操作,效果良好[24]。本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)可控因素進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),優(yōu)化生物修復(fù)條件,確定最優(yōu)生物修復(fù)范圍,為下一步W2菌肥的研制和田間實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),為最終解決異噁草酮的后茬危害問(wèn)題,提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。
[1]劉亞光,閆春秀,趙濱.降解除草劑異噁草酮細(xì)菌的分離、鑒定及生長(zhǎng)特性[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2007,29(3):328-332.
[2]Kaňa R, ? pundová M,Ilík P,et al.Effect of herbicide clomazone on photosynthetic processes in primary barley(Hordeum vulgareL.)leaves[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2004,78(3):161-170.
[3]Yurdagul Ferhatoglu,Michael Barrett.Studies of clomazone mode of action[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,85(1):7-14.
[4]白鶴,趙振,丁偉,等.異噁草酮及其生物降解的研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(8):128.
[5]Denise dos Santos Miron,Alexandra Pretto,Márcia Crestani,et al.Biochemical effects of clomazone herbicide on piava(Leporinus obtusidens)[J].Chemosphere,2008,74(1):1-5.
[6]Rodrigo Figueroa,Marcelo Kogan.Clomazone selectivity among six cucurbit crops[J].Agrociencia,2005,39(6):611-618.
[7]劉亞光,李潔,唐廣順.異噁草酮對(duì)土壤微生物和土壤酶活性的影響[J].植物保護(hù),2010,36(3):85-88.
[8]M ervosh T L,Sims G K,Stoller E W.Clomazone fate in soil as affected by microbial activity,temperature,and soil moisture[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43(2):537-543.
[9]David Gara P M,Bosio G N,Arce V B,et al.Photoinduced degradation of the herbicide clomazone model reactions for naturaland technical systems[J].Photochemistry and Photobiology,2009,85(3):686-692.
[10]閆春秀.異噁草酮降解細(xì)菌的篩選及其降解效果研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,2005.
[11]劉娜,楊云龍.生物修復(fù)技術(shù)在污染環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用研究[J].科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì),2005,15(3):173-175.
[12]唐廣順,劉亞光.影響土壤中異噁草酮生物修復(fù)效果的因子研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(5):53-57.
[13]張超蘭.外源物質(zhì)對(duì)除草劑污染土壤微生物生物量及除草劑快速降解的影響研究[D].杭州:浙江大學(xué)環(huán)境與資環(huán)學(xué)院,2003.
[14]沈德中.污染環(huán)境的生物修復(fù)[M].第1版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:163.
[15]黃星,潘繼杰,孫紀(jì)全,等.降解菌S113對(duì)甲磺隆污染土壤生物修復(fù)作用的研究[J].土壤學(xué)報(bào),2008,45(1):150-154.
[16]Castillo M A,Felis N,Aragón P,et al.Biodegradation of the herbicide diuron by streptomycetes isolated from soil[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2006,58(3-4):196-202.
[17]劉亞光,李潔,唐廣順.影響降解菌Y1降解土壤中異噁草酮的三種因素的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(12):2453-2459.
[18]SmithV R.Moisture,carbon and inorganic nutrient controls of soil respiration at a sub-Antarctic island[J].Soil Biology and Biochemistry,2005,37(1):81-91.
[19]Cook F J,Orchard V A.Relationships between soil respiration and soil moisture[J].Soil Biology and Biochemistry,2008,40(5):1013-1018.
[20]A shim Chowdhury,Saswati Pradhan,Monidipta Saha,et al.Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies[J].Indian Journal of Microbiology,2008,48(1):114-127.
[21]劉亞光,楊謙.長(zhǎng)殘留除草劑廣滅靈生物測(cè)定方法的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(4):463-466.
[22]張曉影.中國(guó)區(qū)域土壤濕度特性分析及評(píng)估[D].北京:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)水資源與環(huán)境學(xué)院,2009.
[23]趙野.土壤中乙草胺降解菌的篩選與主要影響因子研究[D].重慶:西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,2008.
[24]李自剛,王新民,劉太宇,等.復(fù)合微生物菌肥對(duì)懷地黃連作障礙修復(fù)機(jī)制研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(5):62-65.
Optimization of threefactors affecting clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2
Liu Yaguang, Liu Rui, Tang Guangshun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)
[Objective]To optimize the conditions for clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2.[Method]Three factors affecting degradation rate were studied,including the soil moisture content,the amount of inoculation and fertilizer used.Based on the bioassay method,the degradation rates of bacteria W2under different conditions were compared by using orthogonally rotational combination design.[Result]Mathematical regression model for clomazone degradation was established as follows:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22.The results demonstrated that the significance order affecting degradation rate was:the soil moisture content,the amount of fertilize used and the amount of inoculation.[Conclusion]When the amount of inoculation ranged from 8.19 mL/kg to 11.81 mL/kg,soil moisture content ranged from 18.6%to 20.84%,and the amount of fertilizer used ranged from 1.83 g/kg to 2.52 g/kg,the degradation rate was above 60%in air-dried soils containing 500 μ g/kg clomazone after 30 days,close to the highest degradation rate 65.56%.
clomazone; degrading bacteria W2; degradation rate
S 154;S 482.47
A
10.3969/j.issn.0529-1542.2011.03.020
2010-04-13
2010-08-23
黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2007-20);大豆生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(SB08B03)
聯(lián)系方式 E-mail:liuyaguang@sina.com