武曉麗, 陳華民, 吳茂森, 何晨陽(yáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

研究表明,對(duì)植物接種致病菌或病原菌產(chǎn)物可以使植物獲得相關(guān)病害的免疫特性,植物對(duì)病原物侵染的忍耐、抵抗和適應(yīng)性是在兩者共同進(jìn)化過(guò)程中逐漸產(chǎn)生和形成的。由于植物體不具備類似動(dòng)物的免疫系統(tǒng),寄主植物常依賴自身的先天免疫(innate immunity)系統(tǒng)來(lái)抵御病原物的侵染[1]。植物先天免疫系統(tǒng)通過(guò)探測(cè)病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)而被激活,使植物表現(xiàn)抗性[2]。PAMP是進(jìn)化上保守的,來(lái)源于病原物而非植物本身的分子,如病原物鞭毛素、脂多糖、葡聚糖和幾丁質(zhì)分子,都可以激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。目前研究較多的是細(xì)菌鞭毛素和EF-Tu、卵菌七葡聚糖、真菌木聚糖酶[3-6]。由于非病原物也可以產(chǎn)生這類分子,所以又提出了MAMP(microbe-associated Molecular pattern)的概念;凡是進(jìn)化保守的,來(lái)源于微生物可激發(fā)寄主植物防衛(wèi)反應(yīng)的分子稱為MAMP[7]。

與動(dòng)物的免疫機(jī)制不同,植物依靠每個(gè)細(xì)胞的先天免疫性和病原物侵染位點(diǎn)產(chǎn)生的系統(tǒng)信號(hào)來(lái)抵御病原物的入侵。目前認(rèn)為植物被誘導(dǎo)的抗病性主要包括兩部分[8]：第1部分是植物依靠分子模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)識(shí)別進(jìn)化上保守的PAMP,從而激發(fā)植物的PTI(PAMP-triggered immunity)反應(yīng)。PTI反應(yīng)可抑制病原菌侵染植物體,同時(shí)病原菌也進(jìn)化出了抵抗植物PTI的機(jī)制,病原菌通過(guò)干擾PRR與PAMP的識(shí)別,或?qū)⑿?yīng)蛋白注入植物體來(lái)抑制PT I反應(yīng);同時(shí),植物也形成了更加特異的識(shí)別機(jī)制,從而引發(fā)了第2部分抗性：ETI(effector-triggered immunity)反應(yīng),ETI反應(yīng)也被認(rèn)為是一種擴(kuò)大了的PTI反應(yīng),稱為過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response,HR),這種反應(yīng)通常是為了抑制病原菌的侵入而形成的一種程序化細(xì)胞死亡[9]。PTI和ET I均是重要的植物抗性反應(yīng),PTI抗性可以抑制大范圍的病原菌感染[10],ETI抗性則能在植物體內(nèi)形成過(guò)敏反應(yīng),可造成侵染位點(diǎn)細(xì)胞的迅速死亡,這種抗性即稱為基因?qū)蚩剐?gene-for-gene resistance)。但ETI反應(yīng)通常只局限于某個(gè)植物種類的某些成員,而非所有成員,這種抗性是不持久的,因?yàn)椴≡鷷?huì)生成新的效應(yīng)蛋白來(lái)維持對(duì)植物的致病性[11]。

鞭毛是細(xì)菌的主要運(yùn)動(dòng)器官,同時(shí)也是一種重要的致病因子。鞭毛素(flagellin)是組成鞭毛絲的亞基,可形成纖絲結(jié)構(gòu),鞭毛素可作為PAMP因子被寄主識(shí)別,從而誘發(fā)植株一系列防衛(wèi)反應(yīng)。本文將結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室水稻白葉枯病菌相關(guān)的研究進(jìn)展,綜述近年來(lái)鞭毛素激發(fā)植物免疫反應(yīng)方面的最新研究成果。

1 鞭毛素的識(shí)別位點(diǎn)

1.1 鞭毛素flg22誘導(dǎo)植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)

丁香假單胞菌煙草變種菌體粗提物經(jīng)煮沸滅活后,可刺激煙草懸浮細(xì)胞產(chǎn)生堿化反應(yīng);經(jīng)分離純化、測(cè)序后,發(fā)現(xiàn)粗提物中的有效成分是鞭毛素[12]。自此,鞭毛素作為一種可引發(fā)植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)的PAMP因子開始為人們所熟知。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),多種病原菌鞭毛素的 N端呈現(xiàn)高度保守性。flg22是人工合成的鞭毛素N端22個(gè)氨基酸肽段,具有比鞭毛素更強(qiáng)的活性,能夠激發(fā)植物細(xì)胞各種防衛(wèi)反應(yīng)。因此,flg22被認(rèn)為是鞭毛素的活性位點(diǎn),是激發(fā)植物細(xì)胞抗性反應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)段。動(dòng)物細(xì)胞識(shí)別鞭毛素的位點(diǎn)不同于植物細(xì)胞,引起哺乳動(dòng)物炎癥反應(yīng)的病原菌鞭毛素保守的N-末端及C-末端均與植物病原菌鞭毛素存在較大差異,而且動(dòng)物細(xì)胞識(shí)別的鞭毛素保守位點(diǎn)對(duì)于細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性發(fā)揮著更為重要的作用[13]。

盡管細(xì)菌flg22區(qū)段是高度保守的,但個(gè)別氨基酸殘基是可變的。根癌土壤桿菌和青枯病菌鞭毛素flg22區(qū)段某些氨基酸殘基變異后,不能誘導(dǎo)植物細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)[12,14]。甘藍(lán)黑腐病菌鞭毛素flg22的第43位氨基酸殘基是誘導(dǎo)擬南芥防衛(wèi)反應(yīng)的關(guān)鍵位點(diǎn);當(dāng)該位點(diǎn)的天冬氨酸殘基發(fā)生變異后,鞭毛素就會(huì)失去誘導(dǎo)擬南芥防衛(wèi)反應(yīng)的能力[15]。

1.2 鞭毛素flg22以外區(qū)域誘導(dǎo)植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)

在植物-病原菌互作過(guò)程中,鞭毛素flg22外區(qū)域也具有誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)的能力?？汕秩舅尽⒀帑?、玉米等植物的廣寄主病原菌燕麥?zhǔn)乘峋居H和菌株、鞭毛素及flg22區(qū)段均不能誘導(dǎo)水稻細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),而燕麥?zhǔn)乘峋痉怯H和菌株及鞭毛素則可誘導(dǎo)水稻細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),但非親和菌株鞭毛素的flg22區(qū)段卻不能誘導(dǎo)水稻細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),說(shuō)明鞭毛素誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制與flg22誘導(dǎo)擬南芥等十字花科植物是不同的[16-17]。在這兩種機(jī)制中,鞭毛素以及flg22區(qū)段以外的氨基酸序列所發(fā)揮的作用還是未知的。

丁香假單胞菌煙草變種鞭毛素粗提物不能激發(fā)水稻細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)[12]。本室研究表明,親和的水稻白葉枯病菌以及不親和的番茄斑點(diǎn)病菌鞭毛素氨基酸序列同源性高達(dá)98.72%,均不能激發(fā)水稻細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng);兩者與可引發(fā)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的燕麥?zhǔn)乘峋甑谋廾赝葱暂^低,分別為62.35%和52.54%(本室資料)。表明鞭毛素引發(fā)水稻等單子葉植物防衛(wèi)機(jī)制以及鞭毛素作用位點(diǎn)有待深入研究。

2 鞭毛素flg22的受體

2.1 flg22的受體FLS2

動(dòng)物細(xì)胞引發(fā)原初免疫反應(yīng)最重要的PRR類受體蛋白是TLR(toll-like receptor)。TLR是一類位于細(xì)胞膜、富含亮氨酸重復(fù)單元(leucine-rich repeat,LRR)的受體蛋白。迄今已鑒定出11種TLR受體蛋白,其中TLR5被認(rèn)為是鞭毛素受體[13]。通過(guò)篩選對(duì)鞭毛素不敏感的擬南芥突變體,發(fā)現(xiàn)了植物細(xì)胞中的鞭毛素受體FLS2[18]。FLS2編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是一類富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的跨膜受體類激酶(receptor-like kinase,RLK)。FLS2與TLR5的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,均含有一個(gè)胞外 LRR結(jié)構(gòu)域,但 TLR5具有胞內(nèi)TIR區(qū)域,而FLS2卻沒(méi)有,而且兩者與鞭毛素的結(jié)合位點(diǎn)及下游反應(yīng)組分也不同[19]。

近年來(lái),已通過(guò)化學(xué)交聯(lián)和免疫沉淀的方法證實(shí)FLS2與flg22之間的互作[5]。FLS2識(shí)別flg22后可誘發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)一系列的防衛(wèi)反應(yīng)[20],FLS2的磷酸化對(duì)鞭毛素flg22的識(shí)別以及下游信號(hào)的產(chǎn)生是必需的,缺失FLS2的擬南芥突變體植株對(duì)病原細(xì)菌更加敏感[21]。

2.2 FLS2的細(xì)胞內(nèi)吞作用

當(dāng)位于質(zhì)膜的FLS2識(shí)別flg22后,細(xì)胞就會(huì)發(fā)生內(nèi)吞作用,將Fls2-flg22復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞囊泡之中[22]。激酶抑制劑K 252a能夠抑制FLS2發(fā)生內(nèi)吞作用,這說(shuō)明FLS2的磷酸化在內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用。將FLS2的3個(gè)蘇氨酸殘基突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn),FLS2雖然還能夠與flg22結(jié)合,但卻不能發(fā)生內(nèi)吞作用[23]。內(nèi)吞作用對(duì)flg22信號(hào)的傳遞具有重要作用,flg22誘導(dǎo)的經(jīng)渥曼青霉素預(yù)處理的擬南芥細(xì)胞培養(yǎng)基中MAP激酶活性顯著降低,但活性氧猝發(fā)卻沒(méi)有受到影響,說(shuō)明FLS2細(xì)胞內(nèi)吞作用在flg22誘導(dǎo)植物細(xì)胞早期防衛(wèi)反應(yīng)中可能不發(fā)揮作用,但在信號(hào)傳遞過(guò)程中是必需的[24]。

3 flg22誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)

3.1 flg22誘導(dǎo)的早期防衛(wèi)反應(yīng)

flg22可誘導(dǎo)植物細(xì)胞多種防衛(wèi)反應(yīng),其中早期的反應(yīng)包括：離子流的產(chǎn)生(表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)基堿化),活性氧(ROS)的猝發(fā),一氧化氮(NO)的產(chǎn)生,以及胼胝質(zhì)沉積等多種反應(yīng)。

介質(zhì)堿化是包括flg22在內(nèi)的激發(fā)子處理植物細(xì)胞發(fā)生的最早期事件之一,已經(jīng)廣泛作為研究激發(fā)子誘導(dǎo)植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)的指標(biāo)[12,25-26]。早前的研究多認(rèn)為胞外堿化是活性氧引起脂膜過(guò)氧化,造成膜結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而引起電解質(zhì)滲漏造成的[27],目前已基本確定胞外堿化是細(xì)胞發(fā)生的積極生理反應(yīng),由鉀離子和氫離子的交換引起的;同時(shí)鈣離子和氯離子也可能參與了反應(yīng)[28]。

ROS猝發(fā)是植物細(xì)胞受到病原物及flg22等激發(fā)子的刺激最早出現(xiàn)的標(biāo)志性反應(yīng)之一[12,29]。研究表明,植物受到病原物侵染數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)內(nèi),在葉綠體和線粒體質(zhì)子運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中和過(guò)氧化物體的光氧化脅迫中產(chǎn)生大量活性氧[30]。此外,鈣離子的濃度對(duì)植物細(xì)胞ROS的激活是至關(guān)重要的[31]。

NO是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的氣體活性分子,同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的重要信號(hào)分子,具有多種生理功能,因在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮的重要作用得到了廣泛關(guān)注,而后NO在植物細(xì)胞中的作用也陸續(xù)被人們揭示。NO是植物防衛(wèi)反應(yīng)的重要信號(hào)分子,促進(jìn)了過(guò)敏性壞死反應(yīng)的產(chǎn)生和抗病反應(yīng)的激活。在轉(zhuǎn)錄水平上,NO能夠調(diào)節(jié)多個(gè)防衛(wèi)基因的表達(dá),包括編碼PR蛋白和次級(jí)代謝的相關(guān)蛋白[32]。在flg22處理的擬南芥細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到NO信號(hào)分子的存在[33]。

植物細(xì)胞壁的乳突是由于胼胝質(zhì)、富含脯氨酸的糖蛋白和其他物質(zhì)在細(xì)胞壁上沉積所形成的結(jié)構(gòu)[34],乳突的形成增加了細(xì)胞壁的厚度,而胼胝質(zhì)沉積則可使細(xì)胞壁進(jìn)一步增厚,進(jìn)而增強(qiáng)植物細(xì)胞抵御病原菌入侵的能力。經(jīng)flg22處理的擬南芥幼苗24 h后,在子葉和莖部組織都發(fā)現(xiàn)了胼胝質(zhì)沉積現(xiàn)象[35],說(shuō)明flg22可誘導(dǎo)植物細(xì)胞的抗病反應(yīng)。

3.2 flg22誘導(dǎo)的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)

flg22被FLS2識(shí)別,誘導(dǎo)了植物細(xì)胞一系列的早期防衛(wèi)反應(yīng)后,會(huì)進(jìn)一步激活MAPK(mitogenactivated protein kinase)級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)通常涉及3種功能連鎖的蛋白激酶,分別是MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)以及MAPK。這3種激酶按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的順序依次被磷酸化激活,一旦MAPK被激活,就可以磷酸化下游的特異蛋白,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)[36]。

用flg22處理擬南芥原生質(zhì)體后,激發(fā)的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)激酶主要由MAPK激酶激酶MEKK 1,MAPK激酶MKK 4/5和MAP激酶MPK 3/6構(gòu)成,在這個(gè)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中,具有活性的MEKK 1特異的依次激活了 MKK 4/5和MPK 3/6,最終導(dǎo)致位于FLS2下游的特異性轉(zhuǎn)錄因子WRKY 22/WRKY 29被磷酸化[37]。flg22除可激發(fā)MPK3/6外,還可誘導(dǎo)MPK 4的活性,故擬南芥中很可能還存在著MEKK1-MKK 1/2-MPK 4這樣一個(gè)平行于MEKK 1-MKK 4/5-MPK 3/6的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑[38]。雖然這些研究結(jié)果目前尚未有統(tǒng)一的定論,flg22激發(fā)的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路也沒(méi)有得到最終的確認(rèn),但以上結(jié)論均證實(shí)鞭毛素flg22區(qū)段可有效地誘導(dǎo)植物細(xì)胞發(fā)生MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

3.3 BAK 1介導(dǎo)的flg22信號(hào)傳導(dǎo)

BAK 1是一個(gè)具亮氨酸重復(fù)的RLK(receptorlike kinase),涉及了FLS2的信號(hào)傳導(dǎo)[39]。在bak1擬南芥突變體中,FLS2與flg22表現(xiàn)正常的結(jié)合能力,但flg22誘發(fā)的早期和后期防衛(wèi)反應(yīng)卻明顯降低,表現(xiàn)為 AOS的產(chǎn)生大大降低,MAPK 3和MAPK 6的激活也受到了抑制,說(shuō)明BAK 1可能正調(diào)控了flg22所引起的防衛(wèi)反應(yīng)。其調(diào)控機(jī)制可能為BAK 1可以在植物細(xì)胞感受flg22刺激后,迅速地結(jié)合在FLS2-flg22的復(fù)合體中,形成 BAK 1-FLS2-flg22復(fù)合體,進(jìn)而促進(jìn)了flg22誘導(dǎo)的下游防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生[39-40]。

3.4 flg22誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)

除可激發(fā)植物細(xì)胞MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)外,大量的試驗(yàn)證據(jù)表明flg22還可誘發(fā)一系列防衛(wèi)基因的表達(dá),如早期基因 WRKY22/29、FRK1等;晚期基因PR1/5等[37]。經(jīng) flg22處理的擬南芥細(xì)胞中,約1 000個(gè)基因上調(diào)表達(dá),約200個(gè)基因下調(diào)表達(dá),其中RLKs、WRKY轉(zhuǎn)錄因子及一些受體蛋白基因的上調(diào)表達(dá),表明植物細(xì)胞已經(jīng)引發(fā)了對(duì)病原菌入侵的原初防衛(wèi)反應(yīng),而一些與植物激素代謝有關(guān)的基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)則表明細(xì)胞的分化及生長(zhǎng)可能會(huì)被抑制[41]。

4 結(jié)束語(yǔ)

對(duì)于PAMP所激發(fā)的植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究一直是分子植物病理學(xué)所關(guān)注的問(wèn)題之一,隨著大量研究成果的涌現(xiàn),為植物-病原菌互作機(jī)理的深入揭示提供了可靠的依據(jù)。鞭毛素flg22作為研究最為深入的PAMP分子之一,為探索植物免疫反應(yīng)機(jī)制提供了諸多有價(jià)值的理論依據(jù),特別是flg22受體FLS2可發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞作用,是植物中首次發(fā)現(xiàn)的PAMP受體細(xì)胞內(nèi)吞現(xiàn)象。這種類似的現(xiàn)象在動(dòng)物細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn),這說(shuō)明受體蛋白的細(xì)胞內(nèi)吞作用可能是在動(dòng)植物細(xì)胞中普遍存在的一種現(xiàn)象,而其在動(dòng)植物免疫反應(yīng)及獲得抗性的過(guò)程中發(fā)揮的作用還不清楚,相信隨著研究的不斷深入,其機(jī)制會(huì)得到進(jìn)一步闡明。

對(duì)于flg22激發(fā)植物免疫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑目前還沒(méi)有明確的結(jié)論。研究表明,該通路與多種植物激素介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)聯(lián);此外,鞭毛素誘導(dǎo)水稻等單子葉植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)理研究還不是很深入,對(duì)于鞭毛素與單子葉植物互作的活性位點(diǎn)以及在細(xì)胞中的受體的研究都將成為今后的重點(diǎn)。

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