張永波綜述,仇小強(qiáng)審校

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,廣西桂林541001)

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是由于胚胎發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因異常,導(dǎo)致心臟血管發(fā)育異常所形成的一組心血管系統(tǒng)畸形。CHD是人類(lèi)最常見(jiàn)的出生缺陷之一,在新生兒中發(fā)病率估計(jì)為0.4%～5%[1],為嬰兒期非感染死亡的首位病因,也是自然流產(chǎn)和死胎最常見(jiàn)的原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料顯示,全球每年約150萬(wàn)兒童出生時(shí)患有CHD。因此,完整理解心血管系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制,從分子水平探索預(yù)防和治療CHD的措施,對(duì)降低嬰幼兒病死率、提高人口質(zhì)量具有重要意義。

心臟是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成的功能器官。心臟由不同胚層來(lái)源的細(xì)胞發(fā)育而來(lái),是各種細(xì)胞經(jīng)過(guò)精準(zhǔn)的特化、分化、遷移和組織結(jié)構(gòu)的折疊、屈曲的結(jié)果。這一系列復(fù)雜的形態(tài)變化及精密的血流動(dòng)力學(xué)改變均由一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制,其中主要包括堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(bHLH)、NK2、GATA、TBX等。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將上游誘導(dǎo)信號(hào)與下游調(diào)控基因聯(lián)系起來(lái),控制心肌細(xì)胞的增殖和分化、心臟發(fā)育模式及形態(tài)發(fā)生和心臟收縮[2]。bHLH蛋白家族成員眾多、功能龐大在心臟形成過(guò)程中的作用尤為顯著,與CHD的發(fā)生關(guān)系密切。

1 bHLH結(jié)構(gòu)和功能

bHLH包含60個(gè)左右氨基酸殘基,由兩個(gè)α螺旋通過(guò)一段環(huán)狀結(jié)構(gòu)相連接,上游富含堿性氨基酸。兩條雙親性α螺旋的一側(cè)有亮氨酸和苯丙氨酸等疏水氨基酸,兩條鏈依賴疏水氨基酸的相互作用形成同二聚體或異二聚體,螺旋區(qū)含有各種保守的氨基酸殘基。bHLH通過(guò)螺旋-環(huán)-螺旋模體二聚體化,使每個(gè)長(zhǎng)螺旋的堿性部分與DNA上E-盒序列CANNTG結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。缺乏堿性區(qū)肽鏈的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白與bHLH形成異二聚體,可以阻止bHLH與DNA結(jié)合,從而增加其調(diào)控作用的多樣性。bHLH幾乎存在于所有的真核生物中,是胚胎發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子。已知?jiǎng)游颾HLH超家族包含6個(gè)高階組共45個(gè)家族,每個(gè)家族由一至數(shù)個(gè)成員組成,分別在生物體神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腸組織、心臟和造血細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能。目前研究認(rèn)為與心血管發(fā)育關(guān)系密切的bHLH超家族成員主要有HAND家族和HRT家族。

2 心臟神經(jīng)嵴衍生物表達(dá)蛋白(heart and neural crest derivatives,HAND)家族

HAND屬于A組bHLH轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子超家族成員,能夠與具有CACCTG或CAGCTG特征的E框DNA片段特異性結(jié)合。HAND家族有兩個(gè)成員HAND1和HAND2。HAND因子在不同物種之間表現(xiàn)出較高的氨基酸序列一致性,說(shuō)明其生物功能具有高度保守性[3-4]。在心管形成前,HAND首先在心臟前體側(cè)壁中胚層、神經(jīng)嵴和腮弓上表達(dá),然后持續(xù)表達(dá)于整個(gè)心臟發(fā)育過(guò)程中,直到心腔分化完成。雖然在哺乳動(dòng)物心臟形態(tài)形成和早期胚胎心管不對(duì)稱環(huán)化過(guò)程中HAND1和HAND2最初是共同表達(dá)的,但隨后HAND1逐漸主要局限于在左心室表達(dá),HAND2逐漸主要局限于在右心室表達(dá)[5],而在胚胎主動(dòng)脈球囊、心室流出道以及早期室間隔中,HAND1和HAND2基因仍共同表達(dá)[3-4]。在整個(gè)心臟發(fā)育進(jìn)程中,HAND基因表達(dá)逐漸下調(diào)。HAND基因在成人心臟的表達(dá)水平非常低,但在心臟出現(xiàn)疾病的時(shí)候可以再表達(dá),特別在心臟肥大時(shí)HAND基因呈顯著的反應(yīng)性高表達(dá)。HAND1基因在左心室的發(fā)育過(guò)程中起重要作用,Reamon-Buettner等[6]研究發(fā)現(xiàn),HAND1的bHLH結(jié)構(gòu)域一個(gè)功能缺失性移碼突變(p.A126fs)在心臟發(fā)育不全中頻發(fā),在房室間隔缺損的組織樣本中,他們檢測(cè)到32個(gè)序列改變導(dǎo)致氨基酸的改變,其中12個(gè)序列是在HAND1的bHLH結(jié)構(gòu)域。由此可以認(rèn)為,HAND1對(duì)CHD的發(fā)生特別是房室間隔缺損的發(fā)生至關(guān)重要。Risebro等[7]通過(guò)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞研究揭示,在HAND1缺失的背景條件下心肌細(xì)胞分化顯著提高,但決定心肌細(xì)胞命運(yùn)的中胚層通路明顯缺失。由此表明HAND1作為一個(gè)重要的心臟調(diào)節(jié)蛋白,控制著心臟發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖和分化之間的平衡。此外,當(dāng)HAND1基因被插入到Mlc2v基因座內(nèi),HAND1基因在整個(gè)左、右心室發(fā)育過(guò)程中呈強(qiáng)勢(shì)過(guò)度表達(dá)并且引起房室間隔缺損[8]。Nkx2.5基因敲除小鼠的心臟HAND1基因表達(dá)障礙并出現(xiàn)嚴(yán)重的心室畸形,表明HAND1可能受Nkx2.5調(diào)控參與左心室的發(fā)育。HAND2能夠激活UFD1、CDC45等基因的轉(zhuǎn)錄,HAND2基因敲除小鼠出現(xiàn)右心室發(fā)育不良。Shen等[9]通過(guò)對(duì)131例中國(guó)CHD患兒HAND2突變體篩查表明,HAND2可能是右心室和流出道狹窄的潛在候選基因。HAND2缺失小鼠在胚胎發(fā)育9.5～10.5 d之間死于心臟和血管發(fā)育缺陷,表明HAND2缺失對(duì)胚胎發(fā)育是致命性的。內(nèi)皮素及其受體在胚胎神經(jīng)嵴表達(dá),當(dāng)其缺乏時(shí)可出現(xiàn)大血管和心室流出道發(fā)育缺陷。內(nèi)皮素或其受體缺陷小鼠HAND2水平下調(diào),HAND2突變小鼠神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)水平下調(diào),而 NRP-1突變體與內(nèi)皮素突變體具有相似的表型[10],表明在胚胎神經(jīng)嵴發(fā)育過(guò)程中HAND2可能是調(diào)節(jié)內(nèi)皮素和NRP-1表達(dá)的紐帶。形態(tài)學(xué)研究顯示,當(dāng)HAND2缺失時(shí)心管環(huán)化成為右心室的區(qū)域缺失。相關(guān)分子研究表明,小鼠心肌細(xì)胞特化的發(fā)生是因?yàn)樘禺愋孕呐K分子標(biāo)記物的正常表達(dá),然而當(dāng)HAND2缺失時(shí)特異性心室標(biāo)記物A型尿鈉肽前體(Nppa)的表達(dá)下調(diào),而且這種減少由一個(gè)直接轉(zhuǎn)錄效應(yīng)引起[11],相比之下HAND1的轉(zhuǎn)錄則對(duì)Nppa的表達(dá)無(wú)影響。Zhao等[12-13]經(jīng)過(guò)靶點(diǎn)搜尋發(fā)現(xiàn)有一類(lèi)MicroRNA特異地結(jié)合HAND2的mRNA,阻止其翻譯成蛋白質(zhì),提示MicroRNA的異常表達(dá)可以通過(guò)影響HAND2的表達(dá)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育初期心肌前體細(xì)胞的擴(kuò)增受限,進(jìn)而造成心室沒(méi)有足夠心肌細(xì)胞而發(fā)展為畸形。HAND因子的轉(zhuǎn)基因分析表明,HAND1和HAND2都是心血管正常發(fā)育的必需因子。HAND1和HAND2基因全部敲除的小鼠表現(xiàn)出心臟畸形[5]。當(dāng)僅敲除心肌細(xì)胞系條件HAND1無(wú)效等位基因時(shí),圍生期HAND1條件突變體表現(xiàn)出左心室和心內(nèi)膜墊缺失、心室基因表達(dá)失調(diào)[14]。為了進(jìn)一步了解HAND因子在心血管形態(tài)發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)心臟形成的機(jī)制以及直接檢測(cè)HAND1和HAND2的功能冗余,Firuui等[15],把 HAND2基因插入到HAND1基因座內(nèi)(HD1HD2),值得注意的是,含HD1HD2嵌合體百分比高的小鼠在出生時(shí)就已經(jīng)死亡并表現(xiàn)出一系列先天性心臟畸形,表型觀察顯示,在正常發(fā)育的心臟中出現(xiàn)內(nèi)源性HAND1表達(dá)。這些研究表明,哺乳動(dòng)物的HAND基因可能在心臟進(jìn)化過(guò)程中具有錯(cuò)綜復(fù)雜的特殊功能[14],HAND在胚胎發(fā)育不同階段的選擇性表達(dá)是正常心臟形態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵因子。

3 Hairy相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Hairy-related transeription factor,HRT)

HRT屬于E組bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族成員,能夠優(yōu)先與具有CACGCG或CACGAG堿基的N框DNA序列結(jié)合,動(dòng)物HRT包括HEY家族和HES家族。HRT具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,其中bHLH結(jié)構(gòu)域和橙色結(jié)構(gòu)域是共有結(jié)構(gòu)域。HRT的堿性區(qū)結(jié)構(gòu)域有一個(gè)固定的甘氨酸,能夠與DNA特異性結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物對(duì)HRT基因表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄激活作用,由HRT編碼的蛋白又能夠進(jìn)一步調(diào)控自身和其他下游分子的表達(dá)[16],HRT在Notch信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)樞紐作用。HEY家族有 3個(gè)成員 HEY1、HEY2、HEYL,HEY1和HEY2在房室交界區(qū)的表達(dá)具有明顯的邊界,它們可能參與早期心管的分段。HEY1首先表達(dá)于新月形生心區(qū),10.5 d后局限于心房肌中;HEY2在心管形成階段表達(dá)于心室區(qū),當(dāng)心腔形成后局限于心肌致密層[17],HEY1和HEY2的表達(dá)水平在出生后逐漸下降。房室管形成后,在鄰近心肌誘導(dǎo)信號(hào)刺激下內(nèi)皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT),此時(shí) HEYl、HEY2 和 HEYL均在房室管的心內(nèi)膜處表達(dá)。HEYl、HEY2雙突變會(huì)導(dǎo)致EMT不足,HEYl和HEYL則在心血管發(fā)育過(guò)程中控制著內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞移行[18]。HEYl和 HEYL聯(lián)合缺失造成EM T嚴(yán)重低下并導(dǎo)致膜部室間隔缺損和瓣膜發(fā)育不良等多種心臟畸形。HEY2基因缺陷小鼠出現(xiàn)心肌收縮功能受損、右心室畸形、室間隔缺損和法樂(lè)氏四聯(lián)癥[19],并且左心室中檢出較多心房組織標(biāo)志物(ANF、TBX5、Mlcla/2a);而當(dāng) HEY2過(guò)度表達(dá)時(shí),心房標(biāo)志物表達(dá)水平明顯下降[20]。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[21-22],房間隔缺損和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉手術(shù)閉合后血清ANF水平顯著下降。Fischer等[23]認(rèn)為,HEY2通過(guò)抑制心室致密層中廣泛存在的GATA4和GA TA6活性,防止心房標(biāo)志物錯(cuò)誤表達(dá),從而維持心肌的正常發(fā)育。HEY2基因缺失將導(dǎo)致包括室間隔缺損、房室瓣膜缺陷、肺動(dòng)脈瓣狹窄等心臟畸形的發(fā)生,而HEY1基因敲除小鼠沒(méi)有明顯的病理表現(xiàn)。盡管如此,HEY1和HEY2基因雙敲除的小鼠卻由于嚴(yán)重的心血管問(wèn)題死于胚胎期。Kokubo等[24]發(fā)現(xiàn),HEY1和HEY2基因雙敲除小鼠表現(xiàn)出肌小梁缺陷,雖然最初的心室腔具有致密部和小梁部,可是接下來(lái)小梁部的心肌細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致肌小梁的發(fā)育缺陷。上述研究亦表明,在心血管發(fā)育過(guò)程中 HEY1和HEY2可能存在部分功能重疊。HEY1和HEYL雙失活小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的心臟畸形,如膜性室間隔缺損、房室瓣和肺動(dòng)脈瓣發(fā)育異常。HES家族有 8個(gè)成員,其中 HES1、HES2在心血管系統(tǒng)形成過(guò)程中具有重要作用。HES1和HES2過(guò)度表達(dá)可以抑制心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子TBX2和BMP2,導(dǎo)致房室管界線消失,HES1、HES2基因敲除大鼠的TBX2和BM P2基因表達(dá)范圍明顯擴(kuò)大,表明 HES1和HES2可以通過(guò)調(diào)控TBX2和 BMP2基因表達(dá)影響房室管界線形成[25]。

綜上所述,一方面bHLH作為心臟形成過(guò)程中的核心轉(zhuǎn)錄因子,可以與目的基因特異性結(jié)合調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,同時(shí)bHLH的另一結(jié)構(gòu)域可以與其他蛋白因子相互作用調(diào)節(jié)其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的方向和速率。另一方面,編碼bHLH的基因又受其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。如此一來(lái)不同蛋白因子和基因之間交織形成了一個(gè)精密的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雖然通過(guò)大量研究,目前對(duì)心血管發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制已有較多認(rèn)識(shí),但離完整精確地理解還相差甚遠(yuǎn),更談不上真正的用于臨床治療[26]。因此深入研究bHLH在心臟發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步了解其與CHD的關(guān)系具有重要意義。

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