付霞 何志義(審校)

轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦損傷的研究進(jìn)展

付霞 何志義(審校)

一、骨髓基質(zhì)細(xì)胞的概述

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cell，MSC)是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的非造血干細(xì)胞，通常稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymal stem cell)，非造血干細(xì)胞(nonhematopoietic stem cell)或成纖維細(xì)胞形集落(colony-forming-unit fibroblast)。早在1867年，德國病理學(xué)家Cohnheim在研究創(chuàng)傷愈合時就提出了骨髓中存在非造血干細(xì)胞的觀點［1］。20世紀(jì)70年代中期Friedenstein等［2］首先利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長的特性，通過貼壁培養(yǎng)的方法分離得到了骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

以前認(rèn)為骨髓基質(zhì)細(xì)胞主要起支持作用和分泌各種因子、調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖和分化。近來研究表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞具有非造血組織干細(xì)胞的功能，有極大的可塑性，可因外周的微環(huán)境的不同，分化為多種組織細(xì)胞［3］。由于骨髓基質(zhì)細(xì)胞取材方便，體外易于分離和擴(kuò)增，多種外源目的基因可以轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞基因組DNA中，并能長期表達(dá)，移植到體內(nèi)后免疫原性較弱，能夠通過血腦屏障，與宿主大腦細(xì)胞整合，通過自我更新而長期存活，因此骨髓基質(zhì)細(xì)胞成為了一種理想的基因治療缺血性腦損傷的靶細(xì)胞。

二、轉(zhuǎn)染髓基質(zhì)細(xì)胞常用的載體

基因治療的前提是將外源基因有效導(dǎo)入靶細(xì)胞并適量的表達(dá)，因此合適的基因轉(zhuǎn)移載體是決定基因治療效果的關(guān)鍵。目前實驗中常用的載體主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類，這兩類載體各有優(yōu)缺點:病毒載體由于其較高的轉(zhuǎn)染效率而被廣泛應(yīng)用，但是病毒載體不僅難以操控，而且存在一些安全隱患，比如:免疫反應(yīng)、感染，以及由于基因改變造成細(xì)胞的惡性變或永生化;而非病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體，但其具有置備程序比較簡單，外源基因容量大，不受靶細(xì)胞分裂周期的影響，以及毒性低等優(yōu)點。

1.病毒載體:目前實驗中常用于轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的病毒載體有腺病毒載體(adenovirus vector)、慢病毒載體(lentivirus vector)、單純飽疹病毒載體(herpes simplex virus vector)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviruses vector)等。

(1)腺病毒載體:腺病毒載體是目前轉(zhuǎn)基因試驗中最常用的病毒載體之一，其具有宿主范圍較廣，不僅能感染能進(jìn)行分裂的細(xì)胞，也能感染不再分裂的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞的優(yōu)點。腺病毒載體不整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細(xì)胞基因組外，這樣就避免了病毒載體插入宿主細(xì)胞基因組可能引起基因突變等后果，因而使用時更安全。但這同時也造成一些麻煩，由于不整合至宿主細(xì)胞基因組，表達(dá)外源基因的時間較短(僅數(shù)周)，不適合長期表達(dá)。因其還有體內(nèi)的免疫反應(yīng)和基因容量有限等缺點，限制了腺病毒載體的實際應(yīng)用和發(fā)展。隨著人們對于生物分子和免疫因子在體內(nèi)作用過程的理解逐漸加深，在過去的幾年里，人們已經(jīng)在構(gòu)建更有效的載體方面取得了大跨步的發(fā)展。

Hicks等［4］用腺病毒載體將人IL-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞第10天的表達(dá)量最高，達(dá)19350pg(或 38IU)IL-2/106細(xì)胞/24h，在13天內(nèi)能檢測到IL-2的表達(dá)，分泌的IL-2在混合淋巴細(xì)胞試驗中能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。Koch等［5］用腺病毒載體將熒光素酶或BMP-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，證實暴露時間是影響腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞毒性的重要因素之一，其暴露時間不應(yīng)超過4個小時，延長暴露時間會導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。Mizuguchi等［6］應(yīng)用經(jīng)纖維修飾的腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果超過95%的骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)基因，其轉(zhuǎn)基因活性是傳統(tǒng)腺病毒的460倍。

(2)慢病毒栽體:研究表明［7］，以 HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的這類慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，適于體內(nèi)基因治療，因此有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。

Zhang等［8］將以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，EGFP表達(dá)時間超過5個月，而且慢病毒轉(zhuǎn)染不影響B(tài)MSCs傳代并分化為其它功能細(xì)胞。Lee等［9］應(yīng)用含CMV、EF1α或PGK啟動子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染EGFP至胚胎獼猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rhMSC)，證明含啟動子的慢病毒載體可在體外有效轉(zhuǎn)染 rhMSC(轉(zhuǎn)染率:CMV＞EF1α＞PGK)，并且不會抑制rhMSC的分化潛能。McMahon等［10］在實驗中比較腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒及非病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的效率及毒性，結(jié)果慢病毒的轉(zhuǎn)染率最高，同時細(xì)胞毒性很低;腺病毒也有較高的轉(zhuǎn)染率，但隨著病毒滴度的升高，細(xì)胞死亡率明顯升高;腺相關(guān)病毒只對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞有效，而對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞無效;脂質(zhì)體有中度的轉(zhuǎn)染率并伴有一定的細(xì)胞死亡，電穿孔被證明無效并有很高的細(xì)胞死亡率。

雖然慢病毒載體的體外試驗令人鼓舞，但體內(nèi)的表達(dá)效率還很低。因此，一方面要進(jìn)一步提高慢病毒載體在細(xì)胞中的表達(dá)水平，另一方面要提高動物體內(nèi)表達(dá)效率。

(3)單純皰疹病毒載體:單純皰疹病毒載體具有以下優(yōu)點:①宿主細(xì)胞廣泛;②病毒滴度高;③外源基因容量大;④對神經(jīng)細(xì)胞具有嗜向性，可在神經(jīng)元細(xì)胞中建立終生潛伏性感染。HSV載體的不足之處在于它的毒性。

Zhao等［11］應(yīng)用HSV-1載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生長因子(HGF)至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，然后用該骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療腦缺血大鼠，證明移植后一天MSC-HGF治療組缺血腦組織中HGF蛋白的表達(dá)量高于單純MSC治療組，并持續(xù)至少兩周。Ikeda等［12］應(yīng)用HSV-1載體轉(zhuǎn)染成纖維成長因子-2(FGF-2)至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，治療大鼠局灶性腦缺血，也得到了相似的結(jié)果。說明HSV-1載體可將外源基因轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并能長期穩(wěn)定表達(dá)。

(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體:逆轉(zhuǎn)錄病毒只感染具分裂復(fù)制能力的細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)增殖快，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染相對容易。用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率報道不一，從18%到99%不等。Bartholomew等［13］已在體內(nèi)模型上證實了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的可行性。他們將人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)基因轉(zhuǎn)染給狒狒的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，可以異體或自體移植。能夠在移植后持續(xù)137天分泌hEPO，并伴隨狒狒體內(nèi)紅細(xì)胞容積上升。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體難以達(dá)到高滴度，而且只能轉(zhuǎn)導(dǎo)處于分裂期的靶細(xì)胞，因此對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率亦不高，此外由于它可整合至靶細(xì)胞染色體的任意位置，因此具有插入突變的潛在危險。基于以上原因，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在近年來的基因治療研究中地位已有所降低。

2.非病毒載體:非病毒載體中最常用的就是陽離子脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體是一種本身帶正電的脂質(zhì)囊泡，它與帶負(fù)電的DNA分子穩(wěn)定結(jié)合并能通過細(xì)胞的質(zhì)膜，從而將目的基因傳遞到細(xì)胞內(nèi)與基因組整合。

張紅梅等［14］應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SCF cDNA至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞SCF mRNA水平表達(dá)量高于對照組，其細(xì)胞培養(yǎng)上清協(xié)同GM-CSF刺激骨髓細(xì)胞形成集落數(shù)比GM-CSF單獨作用高，說明脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)富集的骨髓基質(zhì)細(xì)胞并表達(dá)，且轉(zhuǎn)染上清具有生物學(xué)活性。楊輝俊等［15］用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染bFGF基因至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，觀察到骨髓基質(zhì)細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)bFGF蛋白至少4周。李興貴等［16］應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(hNT-4)至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，治療缺氧缺血性腦損傷，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和原位雜交分析，證實轉(zhuǎn)染后骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)hNT-4蛋白和mRNA。由于脂質(zhì)體載體的轉(zhuǎn)染效率非常低，當(dāng)前的實驗研究中，僅國內(nèi)有一些研究者應(yīng)用脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染外源基因至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，國外很少應(yīng)用。

為了提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，德國Amaxa公司研究出了一種新技術(shù)——NucleofectorTM技術(shù)，其在世界上第一次實現(xiàn)了非病毒載體與高轉(zhuǎn)染效率的完美結(jié)合，特別適用于轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞和難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系［17，18］。該方法將傳統(tǒng)的電穿孔技術(shù)和專用的轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合起來，針對不同的細(xì)胞類型，采用一套最理想的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染程序，直接將DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核內(nèi)，因而實現(xiàn)了因受到細(xì)胞分裂的限制而一直困擾人們的原代細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)染。

Nakashima 等［19］和 Aluigi等［20］分別在不同的實驗中證明NucleofectorTM技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的效率高于其他非病毒載體，Aluigi等［20］還證實NucleofectorTM技術(shù)轉(zhuǎn)染白介素-12基因至骨髓基質(zhì)細(xì)胞后，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子可持續(xù)大量表達(dá)至少3周，并且不會破壞它的生物學(xué)活性。

NucleofectorTM技術(shù)與脂質(zhì)體等非病毒轉(zhuǎn)染載體相比有很多優(yōu)點:①前者可以直接將目的基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞核;后者是利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的親合性先將目的基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞漿，然后在細(xì)胞分裂時被攝入細(xì)胞核。②前者因為結(jié)合了電轉(zhuǎn)與轉(zhuǎn)染緩沖液，并在實驗室里對特定細(xì)胞進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化;所以其轉(zhuǎn)染率比后者高。③前者轉(zhuǎn)染不依賴于細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)染前不需要刺激細(xì)胞生長;而且可以成功轉(zhuǎn)染分裂緩慢的細(xì)胞如神經(jīng)元等。而后者轉(zhuǎn)染成功與否及轉(zhuǎn)染率很大程度上依賴于細(xì)胞分裂增值活性，轉(zhuǎn)染前需要刺激細(xì)胞成長(如轉(zhuǎn)染前1天傳代等)，在細(xì)胞對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染才能獲得好的效果。④前者還有轉(zhuǎn)染快(電轉(zhuǎn)僅需3秒)、操作簡單等優(yōu)點。NucleofectorTM技術(shù)的諸多優(yōu)點，為基因轉(zhuǎn)染研究以及基因治療的臨床應(yīng)用提供了一種新的手段。

三、所轉(zhuǎn)染的目的基因

在轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦損傷的實驗中，其所攜帶的目的基因主要分為兩類:一種是增加療效的神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，另一種是使骨髓基質(zhì)細(xì)胞永生化的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因。

1.神經(jīng)營養(yǎng)因子基因:骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦損傷的主要作用機(jī)制之一就是增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，為了進(jìn)一步增加其療效，許多科學(xué)家將表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞來治療缺血性腦損傷。Kurozumi等［21］利用一種腺病毒載體分別將BDNF和GDNF基因轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞，然后將基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植到一過性大腦中動脈閉塞模型大鼠的缺血側(cè)紋狀體中，結(jié)果MSC-BDNF和MSC-GDNF治療組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)顯著優(yōu)于對照組，腦梗死灶體積顯著小于單純MSC治療組。Nomura等［22］將BDNF基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)靜脈途徑移植到永久大腦中動脈閉塞的大鼠模型中，也得到了與Kurozumi等相似的結(jié)果。而 Ikeda［12］和 Zhao［11］等則分別應(yīng)用 FGF-2 和HGF基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞來治療腦缺血大鼠也均取得了優(yōu)于單純應(yīng)用MSC的治療效果。

2.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因:端粒是真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，在維持染色體的結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用［23］。在每次細(xì)胞分裂時，端粒隨著細(xì)胞有絲分裂而逐漸縮短，所以又被稱為“有絲分裂鐘”。目前認(rèn)為:端粒酶在細(xì)胞的衰老、死亡及永生化過程中起著重要作用。成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞缺乏端粒酶活性，體外培養(yǎng)只能傳20代左右，極大地限制了臨床研究和應(yīng)用。導(dǎo)入外源人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因可激活細(xì)胞端粒酶活性，維持端粒長度［24］。樸明學(xué)等［25］將外源性hTERT基因?qū)氤扇斯撬杌|(zhì)細(xì)胞，結(jié)果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平均有穩(wěn)定表達(dá)，hMSC-hTERT細(xì)胞可穩(wěn)定傳至第82代，其形態(tài)與hMSC有明顯不同，細(xì)胞短小，成三角形或棱形，核仁明顯可見，增殖能力強(qiáng)，平均2 d傳代1次，凍存、復(fù)蘇不影響其增殖特性，在一定誘導(dǎo)條件下，永生化的hMSC細(xì)胞能夠在體外分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。Honma等［26］將外源性hTERT基因?qū)氤扇斯撬杌|(zhì)細(xì)胞，并應(yīng)用該永生化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療一過性大腦中動脈閉塞的大鼠，結(jié)果hTERT-MSCs治療組大鼠腦梗死面積小于對照組，神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于對照組。

3.其他基因:另外，還可以將具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞以提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的存活率。雖然目前還沒有此類報道，但已有相似研究的報道。Wang等［27］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將bcl-2基因制成轉(zhuǎn)基因動物后，其高效表達(dá)bcl-2蛋白的骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基處理后自身的凋亡數(shù)量少于正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞。因此認(rèn)為，骨髓基質(zhì)細(xì)胞bcl-2基因高表達(dá)可減少骨髓基質(zhì)細(xì)胞的凋亡，推測bcl-2轉(zhuǎn)基因預(yù)處理后的個體骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為移植供體能提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植后的成活率。Wei等［28］證實，在體外將bcl-2基因轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎干細(xì)胞中，可以增加其在腦缺血大鼠腦內(nèi)的存活與分化，并促進(jìn)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。如果將該實驗中的胚胎干細(xì)胞換成更易于獲得的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，相信也應(yīng)該可以得到類似的結(jié)果。因此，將具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細(xì)胞來治療缺血性腦損傷應(yīng)該是一條可行的途徑。

四、問題與展望

盡管骨髓基質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦損傷的治療中顯示了巨大的應(yīng)用價值，但目前還存在一些問題有待解決:(1)還沒有找到明確而特異的骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒別;(2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植后，其遷移、分化的機(jī)制仍不明確;(3)植入體內(nèi)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能否與宿主神經(jīng)細(xì)胞確實建立神經(jīng)環(huán)路仍屬未知，還需要超微結(jié)構(gòu)和電生理方面的研究來證實;(4)移植后只有少量細(xì)胞能分化為神經(jīng)細(xì)胞，如何提高其在體內(nèi)的成活率及向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力將是今后研究的一個重要問題。這些問題的解決，將會給缺血性腦血管病的治療帶來一場革命性的進(jìn)步。

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110000 遼寧大學(xué)校醫(yī)院內(nèi)科(付霞);中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(何志義)