劉曉輝,郎洪彥,金海國,羅曉彤,劉 錚,王曉陽

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺 136100)

豬卵母細(xì)胞體外成熟的研究進(jìn)展

劉曉輝,郎洪彥,金海國,羅曉彤,劉 錚,王曉陽

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺 136100)

綜述了豬卵母細(xì)胞體外成熟的分子機(jī)理和影響因素，以期為后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)。

豬；卵母細(xì)胞；體外成熟

卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)是隨著動物胚胎體外生產(chǎn)(IVP)技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展而起來的。IVM是體外受精、核移植、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，受到眾多因素的調(diào)控，其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。

盡管豬卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)至今已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，并已經(jīng)建立了比較完善的體外成熟培養(yǎng)體系，但卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量還不夠高，達(dá)不到大量生產(chǎn)體外胚胎的要求，還有待于進(jìn)一步完善提高。

1 卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理

卵母細(xì)胞體外成熟是指在體外特定的條件下，經(jīng)過一系列生長發(fā)育最終形成有受精、胚胎發(fā)育能力的過程。卵母細(xì)胞的成熟包括細(xì)胞核的成熟和細(xì)胞質(zhì)的成熟，核成熟先于質(zhì)成熟。細(xì)胞核成熟包括：卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂、細(xì)胞核膜破裂、核仁發(fā)生致密化、生發(fā)泡破裂(GVBD)并發(fā)育到第1次減數(shù)分裂中期；同時，卵母細(xì)胞進(jìn)一步跨越第1次減數(shù)分裂中期，排出第1極體，并停止于第2次減數(shù)分裂的中期，直到受精、激活后才完成第2次減數(shù)分裂并排出第2極體。細(xì)胞質(zhì)的成熟包括：細(xì)胞器的變化和細(xì)胞基質(zhì)的變化。皮質(zhì)顆粒在胞質(zhì)合成后，逐漸遷移到質(zhì)膜下的皮質(zhì)區(qū)。高爾基復(fù)合體最初位于核的周圍，成熟過程中移向皮質(zhì)，皮質(zhì)顆粒完全形成后，高爾基復(fù)合體在皮質(zhì)中消失。發(fā)育早期的線粒體為圓形或橢圓形，主要分布于皮質(zhì)部，卵母細(xì)胞成熟后，線粒體又移向核周圍，形成幼稚型線粒體。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得很少。胞質(zhì)成熟的特點(diǎn)就是積累一些穩(wěn)定的mRNA，并在卵母細(xì)胞成熟的一定階段進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯。并且，細(xì)胞質(zhì)成熟與細(xì)胞核成熟中有些內(nèi)容也是相互關(guān)聯(lián)的。有些細(xì)胞質(zhì)成熟過程依賴于細(xì)胞核成熟。因此，只有當(dāng)體外成熟和體內(nèi)成熟非常接近的生活環(huán)境，才能獲得較高的成熟率。

核、質(zhì)的成熟與卵丘細(xì)胞的成熟及其卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體的發(fā)育成熟之間也存在著復(fù)雜的相互促進(jìn)和相互抑制作用。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，從腔前卵泡來的卵母細(xì)胞剝?nèi)ヮw粒細(xì)胞或與散在的顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)，都不能進(jìn)行明顯的生長[1]。這是由于卵母細(xì)胞的生長依賴于與它周圍的顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接所介導(dǎo)的通訊，其生長速度與它周圍的顆粒細(xì)胞有關(guān)[2]。這些雖然被人們所了解，但機(jī)理還不是非常清楚，有待于進(jìn)一步的探索，以使體外成熟效果與體內(nèi)成熟的效果趨于一致。

2 影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素

2.1 動物的種類、年齡及健康狀況

豬不同品種之間，其卵母細(xì)胞質(zhì)量也存在差異，如瘦肉型豬與非瘦肉型豬，野豬與家豬，外國品種與國內(nèi)品種。即便是國內(nèi)不同省份的品種，也可能因遺傳背景、特定營養(yǎng)環(huán)境、氣候條件的不同，導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量和體外成熟培養(yǎng)的差異。

同一豬種在不同年齡、個體其卵母細(xì)胞體外成熟的情況也有所不同。成年期的健康豬體其卵巢表面直徑3～6 mm卵泡比例較高，所抽取的卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻、形態(tài)完好、裸卵較少，體外培養(yǎng)效果好。初情期前的青年母豬的卵巢卵母細(xì)胞體外成熟后可得到后代，但是效率不如成年母豬卵巢體外成熟的卵母細(xì)胞，即使是性成熟后還沒有懷孕經(jīng)歷。而且，發(fā)情周期漸趨正常的青年母豬其卵母細(xì)胞在支持后期發(fā)育上也比初情期前的青年母豬好[3]。但是，Kuhholzer等體細(xì)胞核移植(SCNT)時經(jīng)產(chǎn)母豬以及初情期前母豬卵母細(xì)胞對發(fā)育影響不大[4]。

2.2 卵母細(xì)胞的分級

包裹在卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞的層數(shù)也影響著卵母細(xì)胞的體外成熟。不同的研究者對卵母細(xì)胞的分類不盡一致。根據(jù)卵母細(xì)胞外卵丘細(xì)胞的有無和層數(shù)，豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體分5級[5]。A級：擴(kuò)展且顏色較暗，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；B級：卵丘細(xì)胞顏色較淺且稀疏的，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；C級：有3～5層卵丘細(xì)胞緊密包裹的均勻胞質(zhì)卵母細(xì)胞；D級：卵丘細(xì)胞稀少，胞質(zhì)不均勻；E級：裸卵、黑卵。A、B級可以用于體外成熟培養(yǎng)，一般成熟率較高，而C、D級則效果較差，E級不能用于體外培養(yǎng)。

2.3 卵巢運(yùn)輸

卵巢一般都從離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)的屠宰場獲得，要考慮卵巢保存的溫度和離體時間對卵母細(xì)胞成熟率的影響。Yang等系統(tǒng)進(jìn)行了運(yùn)輸溫度和儲存時間的比較，其結(jié)果表明，牛卵巢在24℃保存24 h后收集的卵母細(xì)胞體外受精后不影響其后期發(fā)育[6]。與其他哺乳動物相比,豬卵母細(xì)胞對溫度特別敏感,卵巢的回收溫度較高或較低,卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)效果極差甚至是退化。較合適的回收溫度是32～35℃。當(dāng)卵巢回收溫度低于25℃,豬的卵母細(xì)胞將受到冷休克的打擊。當(dāng)回收溫度為36～39℃、25～28℃、14～17℃時,豬體外受精的卵裂率分別為52.3%、49.8%和28.8%[7]。Pimprapar比較了把豬卵巢分別放于4℃、15℃、25℃和35℃保存0 h、3 h、6 h和9 h后IVM、IVF，發(fā)現(xiàn)在25～35℃保存6 h仍可以有效維持豬卵的發(fā)育能力，但是發(fā)育率比35℃保存3 h的低。

2.4 生長因子

生長因子對卵母細(xì)胞成熟的作用是正向的。發(fā)育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時影響卵膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖和分化，并參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。顆粒細(xì)胞一旦開始增殖分化，就分泌大量的細(xì)胞因子,如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、白細(xì)胞介素(IL)、神經(jīng)生長因子(NGF)、干擾素-r(IFN-r)、抑制素和活化素等，這些因子對卵母細(xì)胞的生長起決定作用。在豬的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中，研究較多的就是表皮生長因子(EGF)。EGF是一種卵母細(xì)胞成熟的誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)COCs的體外成熟，在COCs上存在EGF受體，隨著卵泡的發(fā)育表達(dá)增強(qiáng)，排卵前達(dá)到高峰[8]。EGF能夠誘導(dǎo)豬[9]、牛[10]體外培養(yǎng)卵子的卵丘擴(kuò)散，并促進(jìn)核成熟。EGF能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟過程中蛋白質(zhì)的合成，提高卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟質(zhì)量，添加EGF培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育能力更強(qiáng)[11]。另有研究報(bào)道，EGF對豬雌性原核形成有促進(jìn)作用，EGF不但能促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，也間接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞漿的成熟。

2.5 卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(MPF)

MPF是一種蛋白激酶，由調(diào)解亞基細(xì)胞周期蛋白CyclinB和催化亞基p34 cdc2兩種蛋白組成的復(fù)合體，它以非激活的前體物質(zhì)存在于成熟前的卵母細(xì)胞中。Cdc2和CyclinB的變化直接影響到MPF的活性。p34cdc2在無分裂能力的卵母細(xì)胞中含量很低，體外成熟后含量則明顯提高，這表明卵母細(xì)胞成熟分裂能力的恢復(fù)與p34 cdc2的濃度有關(guān)。CyclinB隨著細(xì)胞周期的變化而周期性地產(chǎn)生，在分裂間期這種周期蛋白不斷積蓄，超過激活MPF的臨界值，在分裂后期這種蛋白降解造成MPF復(fù)合體的失活。MPF前體轉(zhuǎn)化為MPF需p34cdc2去磷酸化。而CyclinB不僅是MPF的調(diào)節(jié)亞基，而且還可以直接激活與MPF激活有關(guān)的cdc25酪氨酸磷酸酶。此外，CyclinB在激活MPF的同時還激活了p39mos，p39mos控制微管組織中心的變化，影響紡錘體的形成[12]。

2.6 卵泡液

卵泡液是卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育的介質(zhì)，含有大量來自血清的生化因子和卵母細(xì)胞及卵泡細(xì)胞的分泌因子，對卵母細(xì)胞成熟具有重要調(diào)節(jié)作用。主要表現(xiàn)在提高卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的質(zhì)量，增強(qiáng)胚胎的發(fā)育能力[13]。Yoshida等檢測出豬卵泡液(pFF)中含有一種分子量介于1萬～20萬道爾頓的酸性基質(zhì),在成熟液中添加豬卵泡液顯著提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率。因此，在卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)中，都要添加一定比例的卵泡液，以促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟。并且，在體外條件下，pFF能有效降低豬卵母細(xì)胞染色體異常的發(fā)生率，調(diào)解和加速極體排出，使核質(zhì)成熟趨于同步化。但添加過高則抑制卵母細(xì)胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加10%pFF可促進(jìn)豬卵母細(xì)胞在體外的核成熟?？刂破錆舛?，一方面消除了對核成熟的抑制作用，另一方面又突出了對胞質(zhì)成熟的促進(jìn)作用。

2.7 卵母細(xì)胞成熟抑制因子(OMI)

OMI是指卵泡液中能夠抑制卵母細(xì)胞成熟的物質(zhì)。OMI是一個多肽，分子量約為1～2 kDa,許多哺乳動物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中可阻止自發(fā)減數(shù)分裂成熟。目前研究較多的成熟抑制因子有環(huán)核苷酸和嘌呤。在體外，通過抑制磷酸二酯酶活性阻止細(xì)胞內(nèi)cAMP降解或是通過激活腺苷酸環(huán)化酶升高細(xì)胞內(nèi)cAMP的試劑，都可以抑制卵母細(xì)胞的成熟。因此，卵母細(xì)胞中的cAMP是控制減數(shù)分裂阻滯的重要因子，同時它也能抑制GVBD的發(fā)生。有的研究表明,次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)是卵泡液低分子量組分中能夠抑制卵母細(xì)胞成熟的主要成份。豬卵泡液中HX的濃度為1 141mmol/L[14]。HX在(1～6)mmol/L濃度內(nèi)，能夠劑量依賴性地抑制豬裸卵母細(xì)胞的自發(fā)成熟[15]。HX對豬卵母細(xì)胞成熟的抑制作用，與卵母細(xì)胞內(nèi)的cAMP的水平有關(guān)。已知cAMP可以抑制卵母細(xì)胞成熟，而HX可以抑制磷酸二酯酶(PDE)的活性,使卵母細(xì)胞內(nèi)的cAMP處于高濃度狀態(tài),從而抑制卵母細(xì)胞成熟[16]。

2.8 激素

激素是哺乳動物卵母細(xì)胞成熟的重要物質(zhì)。目前,絕大多數(shù)研究者在卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)過程中，添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物。但是，它們在卵母細(xì)胞體外成熟過程中的作用及作用機(jī)理尚未清楚。根據(jù)已有的研究結(jié)果推測，激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂可能通過2條途徑：①誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)散使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的間隙連接中斷，使卵丘細(xì)胞的信息不能傳入卵母細(xì)胞，從而解除卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的抑制作用，重新啟動減數(shù)分裂。②誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞產(chǎn)生一些刺激因子，克服抑制物質(zhì)的作用而恢復(fù)減數(shù)分裂?，F(xiàn)在，體外成熟培養(yǎng)中，主要以添加LH和hCG為主。Funashi等的研究表明,在豬卵母細(xì)胞體外成熟時,培養(yǎng)的前20h加入激素，培養(yǎng)20h后去掉激素,可增加卵母細(xì)胞體外成熟率,促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和細(xì)胞質(zhì)成熟。同時指出,在豬卵母細(xì)胞體外成熟中,有兩個關(guān)鍵步驟是受激素調(diào)節(jié)的。一是核成熟,它可由培養(yǎng)的前20h加入激素所激發(fā)；二是細(xì)胞質(zhì)成熟,在培養(yǎng)的后20h去掉一部分或全部激素可以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的成熟[17]。DelosReyes[18]等的研究也發(fā)現(xiàn),在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的第2階段去掉激素可以提高卵母細(xì)胞的體外成熟率。

2.9 培養(yǎng)條件

不同動物體外成熟所需的濕度、溫度和氣相有所不同。不同動物的卵母細(xì)胞, 其最適培養(yǎng)溫度不同, 人和哺乳動物細(xì)胞最適的溫度為37℃。豬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)多采用38.5～39℃。對于氣相條件，體外培養(yǎng)的COCs所處的環(huán)境和體內(nèi)生理環(huán)境大相徑庭，而卵母細(xì)胞為了更好的生存，必然會調(diào)動一些機(jī)制來適應(yīng)體外培養(yǎng)的環(huán)境，導(dǎo)致負(fù)擔(dān)增加，也必然影響其最后的成熟。由于體內(nèi)卵母細(xì)胞所處的環(huán)境氧濃度比空氣中的分壓低得多。所以，有人嘗試?yán)玫脱醴謮?，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)COCs，CO2濃度為5%。卵母細(xì)胞的核成熟受影響不明顯，但是體外受精以及孤雌激活胚都得到了很好的后期發(fā)育[19]。但是，也有人認(rèn)為高氧時IVF胚發(fā)育較好。因此，有必要進(jìn)行更深入的研究。

2.10 培養(yǎng)時間

哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時間通常是22～24 h。但豬比較特殊，通常需要44～48 h左右能達(dá)到核成熟，24 h時的核成熟率幾乎為零。雖然延長培養(yǎng)時間可以使核成熟率逐步增高,但豬的卵母細(xì)胞會逐漸老化。因此，在保證一定的核成熟率的前提下，有必要縮短豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時間。

3 結(jié)語

隨著豬體外受精(IVF)、核移植(NT)、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對卵母細(xì)胞的要求越來越大，如何獲得大量高質(zhì)量卵母細(xì)胞變得尤為重要。通過超數(shù)排卵技術(shù)來獲取體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞不僅數(shù)量有限且成本高昂，所以通過屠宰場獲取卵巢，抽取未成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)，不僅僅可以獲取大量的卵母細(xì)胞，還可以大大降低卵母細(xì)胞的成本。但經(jīng)體外成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)量參差不齊，其質(zhì)量的優(yōu)劣和成熟率的高低直接影響胚胎后期的發(fā)育。要提高卵母細(xì)胞發(fā)育的潛力，還要依賴卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化。

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S828.3

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1005-2739（2011）04-0007-05

2011-02-16

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目《利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的研究》（20080566）

劉曉輝(1974-),男，助理研究員，碩士。

王曉陽(1956-)，男，副研究員。