焦迪 潘鵬丞 謝 婉 張其偉 曾令湖 孫甜甜 陳寶劍 關(guān)志惠 謝炳坤

摘要：【目的】克隆陸川豬胰島素生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）基因，并明確其在不同豬種中的表達(dá)情況，為今后揭示IGFBP5基因在陸川豬肌肉發(fā)育中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^TRIzol法提取陸川豬背最長肌總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將正確的測序結(jié)果采用在線生物信息軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析IGFBP5基因在陸川豬和杜洛克豬背最長肌中的表達(dá)差異。【結(jié)果】陸川豬IGFBP5基因編碼區(qū)（CDS）序列全長816 bp，編碼271個(gè)氨基酸，與NCBI上已公布的野豬IGFBP5基因（NM_214099.1）CDS序列相比，存在3處堿基差異，其核苷酸同源性為99.6%。陸川豬IGFBP5氨基酸序列與NCBI上已公布的野豬（NM_214099.1）、牛（NM_001105327.2）、水牛（NM_001290940.1）、馬（NM_001308603.2）、人類（NM_000599.3）、獼猴（NM_001284032.1）、小鼠（NM_010518.2）和大鼠（NM_012817.1）IGFBP5氨基酸序列同源性分別為98.9%、98.2%、98.9%、97.4%、96.7%、97.4%、95.2%和95.2%;基于IGFBP5氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，陸川豬與野豬的遺傳距離最近。陸川豬IGFBP5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲占比最高，為65.68%;陸川豬IGFBP5蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，在第1～20位氨基酸殘基存在1個(gè)信號(hào)肽序列;蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，陸川豬IGFBP5蛋白存在2個(gè)O糖基化位點(diǎn)、2個(gè)N糖基化位點(diǎn)和多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，包含IB保守結(jié)構(gòu)域和Thyroglobulin-1保守結(jié)構(gòu)域。IGFBP5基因在杜洛克豬背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其在陸川豬背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量（P<0.01）?！窘Y(jié)論】IGFBP5基因保守性較強(qiáng)，其在不同豬種間的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致豬肉瘦肉率差異的主要原因，可作為陸川豬胴體重和瘦肉率等生長性狀的遺傳標(biāo)記予以開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 陸川豬;IGFBP5基因;背最長肌;生物信息學(xué);生長發(fā)育;差異表達(dá)

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）06-1347-09

Abstract：【Objective】In this study， the insulin growth factor-binding protein 5（IGFBP5） gene was cloned and its expressions in different pig breeds were determined，which provided theoretical basis for revealing the mechanism of IGFBP5 gene in the muscle development of Luchuan pig. 【Method】The total RNA of the longissimus dorsi muscle of Luchuan pig was extracted by Trizol method and cDNA was reverse transcribed then amplified by PCR. According to the correct sequencing results， the online bioinformatics software was applied to analyze it bioinformatics， and? expression of IGFBP5 gene in the longissimus dorsi of Luchuan pig and Duroc pig was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Result】The results showed that the coding region（CDS） of Luchuan pig IGFBP5 gene was full-length 816 bp and encoded 271 amino acids. Compared with the CDS sequence of the published wild pig IGFBP5 gene（NM_214099.1） on NCBI， there were three base differences with nucleotide homology of 99.6%. Homology between the amino acid sequence encoded by the IGFBP5 gene of Luchuan pig and the amino acid sequence encoded by the IGFBP5 gene in wild pig（NM_214099.1）， bovineNM_001105327.2），buffalo（NM_001290940.1），horse（NM_001308603.2），human（NM_000599.3），rhesus monkey（NM_001284032.1）， mouse（NM_010518.2） and rat（NM_012817.1） published on NCBI were respectively 98.9%， 98.2%， 98.9%， 97.4%， 96.7%， 97.4%， 95.2% and 95.2%. The phylogenetic tree based on the homology of IGFBP5 amino acid sequence also showed that the genetic distance between Luchuan pig and wild pig was the closest. Its secondary structure was composed of alpha-helix， extending strand， beta-turn and random coil， with the highest proportion of random coil being 65.68%. There was no transmembrane structure in Luchuan pig IGFBP5 protein. There was a protein signal peptide in the 1st to the 20th position. The prediction of protein modification structure indicated that there were two O-glycosylation sites， two N-glycosylation sites and multiple potential phosphorylation sites in IGFBP5 protein of Luchuan pig， and also contained the IB conserved domain and Thyroglobulin-1 conserved domain. The expression of IGFBP5 in the longissimus dorsi muscle of Duroc pig was extremely higher than that in the longissimus dorsi muscle of Luchuan pig（P<0.01）. 【Conclusion】The IGFBP5 gene is highly conserved， and its differential expression among different pig breeds may be the main cause of the difference in pork lean rate. It can be used as a genetic molecular marker for growth traits such as body weight and lean meat rate of Luchuan pig.

Key words： Luchuan pig; IGFBP5 gene; longissimus dorsi; bioinformatics; growth and development; differential expression

0 引言

【研究意義】陸川豬具有肉嫩味鮮、體型緊湊、遺傳力穩(wěn)定、繁殖力高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)（黃雅瓊等，2013;焦迪等，2019），屬于脂肪型豬。脂肪是影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素，如豬肉品質(zhì)中的大理石紋、嫩度、多汁性和風(fēng)味均受肌內(nèi)脂肪含量影響;而影響肌內(nèi)脂肪含量的因素較多，包括脂肪細(xì)胞數(shù)量及脂肪沉積能力等（鄧洛娜等，2018）。黃艷娜等（2014a，2014b）研究表明，肌肉生長抑制素基因（MSTN）和脂蛋白酶基因（LPL）均可作為研究陸川豬脂肪沉積的主要候選基因之一;夏琴等（2018）成功克隆獲得陸川豬細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子3基因（SOCS3），為下一步研究陸川豬脂肪沉積的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ);謝婉等（2018）研究證實(shí)，陸川豬G-蛋白偶聯(lián)受體1（GPR1）基因啟動(dòng)子甲基化程度與肌內(nèi)脂肪沉積存在一定關(guān)聯(lián)。因此，加強(qiáng)陸川豬生長性狀相關(guān)基因的研究對(duì)其開發(fā)和利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】胰島素生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）屬于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）家族成員（吳蘇日古嘎，2013），由N端、C端和作為翻譯后修飾主要部分的中央?yún)^(qū)域組成，其中，中央?yún)^(qū)域是結(jié)構(gòu)變化較多的區(qū)域（Kalus et al.，1998），也是IGFBP5具有特殊功能的基礎(chǔ)，如蛋白的磷酸化、水解和糖基化均發(fā)生在中央?yún)^(qū)域（毛勝，2009）。作為IGFBPs家族中最保守的成員，IGFBP5可儲(chǔ)存胰島素樣生長因子，延長胰島素樣生長因子在循環(huán)中的半衰期，進(jìn)而穩(wěn)定其血清濃度，且IGFBP5可不依賴胰島素樣生長因子而獨(dú)立發(fā)揮作用（Arai et al.，1994）。IGFBP5參與諸多生物過程如肌肉生長、皮膚損傷修復(fù)及癌癥發(fā)生等，在肌肉、前列腺、骨、乳腺和腎臟等組織中均有表達(dá)，尤其在肌肉中高表達(dá)（吳蘇日古嘎，2013）。Lehnert等（2007）研究發(fā)現(xiàn)IGFBP5基因在牛肌肉組織中的表達(dá)呈先上升后下降的變化趨勢;McGivney等（2010）研究表明，與未訓(xùn)練過的純血馬相比，訓(xùn)練過的純血馬肌肉中IGFBP5基因mRNA表達(dá)呈下降趨勢;但吳蘇日古嘎（2013）研究發(fā)現(xiàn)，與未訓(xùn)練過的蒙古馬相比，訓(xùn)練過的蒙古馬肌肉組織中IGFBP5基因mRNA表達(dá)量呈上調(diào)趨勢;商鵬等（2016）研究表明，IGFBP5與肌肉分化呈顯著相關(guān)，最早可在大鼠第10 d左右的胚胎肌肉組織中檢測到IGFBP5基因表達(dá)。此外，有研究表明IGFBP5可增加膠原、纖維連接蛋白的產(chǎn)生，促使纖維母細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并轉(zhuǎn)移，加速上皮細(xì)胞衰老，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化，進(jìn)而激活組織纖維溶解酶原激活物（Pilewski et al.，2005;Yasuoka et al.，2006）。劉怡然（2017）研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP5基因可能是miRNA-149-5p直接作用的靶基因，過量表達(dá)的miRNA-149-5p通過抑制IGFBP5基因表達(dá)而參與2型糖尿病的發(fā)生;饒大龐等（2018）研究證實(shí)，IGFBP5基因是miRNA-149的下游靶基因，即mi-RNA-149抑制膀胱癌侵襲可能是通過抑制IGFBP5和PDGFRA蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。【本研究切入點(diǎn)】IGFBP5基因在肌肉中高表達(dá)，且與肌肉分化密切相關(guān)，但至今鮮見有關(guān)陸川豬IGFBP5基因克隆及其調(diào)控機(jī)理的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從陸川豬背最長肌克隆IGFBP5基因，應(yīng)用在線生物信息軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并明確其在不同豬種間的表達(dá)情況，為今后揭示IGFBP5基因在陸川豬肌肉發(fā)育中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

3頭10周齡的陸川豬背最長肌和3頭10周齡的杜洛克背最長肌樣品均從廣西畜牧研究所養(yǎng)殖基地采樣獲得。酵母浸出物和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司;TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體和定量試劑盒購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒購自杭州博日科技有限公司;大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DL5000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;瓊脂糖購自法國Biowest公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI中的野豬IGFBP5基因序列（NM_214099.1），應(yīng)用Oligo 7.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物?？寺∫铮篒GFBP5-F1（5'-ATGGTGCTCACCGCGGTC-3'）和IGFBP5-R1（5'-AAATGAGTGGCGTCTTGGGGTG GA-3'），預(yù)期擴(kuò)增長度909 bp，包含816 bp的編碼區(qū)（CDS）序列;定量引物：IGFBP5-F2（5'-CAATCTGA ACAACTATTGTGC-3'）和IGFBP5-R2（5'-CTATAA CTCTGAGAGGTCT-3'），預(yù)期擴(kuò)增長度208 bp;內(nèi)參引物：GAPDH-F（5'-CTACGTCCTGAGAGAG-3'）和GAPDH-R（5'-CGTGATCGTCCTTCTGCA-3'），預(yù)期擴(kuò)增長度230 bp。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 陸川豬IGFBP5基因克隆

以陸川豬和杜洛克豬背最長肌為樣品，采用TRIzol法提取總 RNA。具體操作：剪取約120 mg背最長肌樣品置于液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉末，將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，加入1.0 mL TRIzol后參照說明提取總RNA;以總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成。反轉(zhuǎn)錄第一步：gDNA Eraser 1.0 μL，總RNA模板2.0 μL，5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL，RNase free ddH2O 5.0 μL;42 ℃ 2 min，4 ℃保存?zhèn)溆?第二步：取第一步反應(yīng)液10.0 μL，5×Prime Script Buffer Ⅱ4.0 μL，RNase free ddH2O 4.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，Prime Script Enzyme MixⅠ1.0 μL;37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：IGFBP5-F1和IGFBP5-R1各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase free ddH2O 3.2 μL，Premix Taq DNA聚合酶5.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進(jìn)行34個(gè)循壞。取8.0 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體在16 ℃下連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，取75.0 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐的LA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落接種于1.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證后，選取陽性菌液基因送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

采用TRIzol法提取10周齡陸川豬和杜洛克豬（各3頭）背最長肌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，cDNA模板5.0 μL，RNase free ddH2O 4.0 μL，IGFBP5-F2和IGFBP5-R2各0.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行37個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3次重復(fù)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因?qū)€(gè)體間差異進(jìn)行矯正，并采用2-ΔΔCt法換算IGFBP5基因的相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 陸川豬IGFBP5基因生物信息學(xué)分析

采用MegALign分析陸川豬IGFBP5氨基酸序列與其他物種的同源性，并基于IGFBP5氨基酸序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;運(yùn)用ProtParam對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，以SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測陸川豬IGFBP5蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，用ProtScale預(yù)測陸川豬IGFBP5蛋白親/疏水性，以MHMM Server預(yù)測陸川豬IGFBP5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，利用SignalP分析陸川豬IGFBP5蛋白信號(hào)肽;采用NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 3.1、NetPhos 3.1 Ser-ver分析陸川豬IGFBP5蛋白N和O糖基化位點(diǎn)、潛在磷酸化位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的蛋白激酶位點(diǎn);運(yùn)用NCBI網(wǎng)站的中CDD工具預(yù)測陸川豬IGFBP5蛋白保守結(jié)構(gòu)域，并以PSORT預(yù)測其亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2. 1 陸川豬IGFBP5基因的克隆

以陸川豬背最長肌cDNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條長約900 bp的特異性條帶（圖1），與目的基因條帶的長度（909 bp）相符。

2. 2 陸川豬IGFBP5基因CDS序列及其生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 陸川豬IGFBP5基因測序分析結(jié)果 測序結(jié)果顯示，克隆獲得的陸川豬IGFBP5基因CDS序列長度為816 bp，共編碼271個(gè)氨基酸，與NCBI上已公布的野豬IGFBP5基因（NM_214099.1）CDS序列相比，共存在3處堿基差異，其核苷酸同源性為99.6%，編碼氨基酸同源性為98.9%。3處堿基突變均為錯(cuò)義突變（圖2），分別是陸川豬IGFBP5基因419 bp處A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第140位的組氨酸突變?yōu)榫彼幔?40His→Arg）;468 bp處A突變?yōu)門，導(dǎo)致第156位的精氨酸突變?yōu)榻z氨酸（156Arg→Ser）;533 bp處T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第178位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸（178Leu→Ser）。

經(jīng)MegALign分析發(fā)現(xiàn)，陸川豬IGFBP5氨基酸序列與NCBI上已公布的野豬（NM_214099.1）、牛（NM_001105327.2）、水牛（NM_001290940.1）、馬（NM_001308603.2）、人類（NM_000599.4）、獼猴（NM_001284032.1）、小鼠（NM_010518.2）和大鼠（NM_012817.1）IGFBP5氨基酸序列同源性分別為98.9%、98.2%、98.9%、97.4%、96.7%、97.4%、95.2%和95.2%（圖3），表明IGFBP5基因在哺乳動(dòng)物中的保守性較強(qiáng)?；贗GFBP5氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）也顯示，陸川豬與野豬的遺傳距離最近，與水牛和牛的遺傳距離次之，遺傳距離最遠(yuǎn)的是小鼠和大鼠。

2. 2. 2 陸川豬IGFBP5蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

IGFBP5蛋白分子量為30260.85 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為8.56，N端殘基為甲硫氨酸（Met），氨基酸組成中谷氨酸（Glu）含量最高，占10.0%，精氨酸（Arg）占8.1%，亮氨酸（Leu）占8.1%，賴氨酸（Lys）占7.7%;帶負(fù)電荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+Glu]36個(gè)，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）43個(gè)。IGFBP5蛋白在體外的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為54.76，其理化性質(zhì)不穩(wěn)定。

2. 2. 3 陸川豬IGFBP5蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用SOPMA程序?qū)GFBP5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)陸川豬IGFBP5蛋白有178個(gè)無規(guī)則卷曲（占65.68%）、48個(gè)α-螺旋（占17.71%）、30個(gè)延伸鏈（占11.07%）和15個(gè)β-轉(zhuǎn)角（占5.54%）。應(yīng)用SWISS-MODEL對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白可能存在的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)存在2種模型（圖6）。

2. 2. 4 陸川豬IGFBP5蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用ProtScale對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白親/疏水性進(jìn)行預(yù)測，然后根據(jù)分值大于0代表疏水、分值小于0代表親水進(jìn)行判斷。結(jié)果表明，第116位氨基酸的疏水分值最小，為-3.389;第6位氨基酸的疏水值最大，為3.167（圖7）。陸川豬IGFBP5蛋白共有192個(gè)親水性氨基酸，71個(gè)疏水性氨基酸，即該蛋白表現(xiàn)為親水性。

2. 2. 5 陸川豬IGFBP5蛋白跨膜區(qū)及其信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果 采用TMHMM Server v.2.0對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖8）;以SignalP 4.1對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在第1～20位氨基酸殘基存在1個(gè)信號(hào)肽序列（圖9）。

2. 2. 6 陸川豬IGFBP5蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析，結(jié)果（圖10）發(fā)現(xiàn)陸川豬IGFBP5蛋白第35、40、104、115、124、132、144、156、162、178、186、198、205、232、264、267和268位的絲氨酸（Ser），第70、122、123、130、141、160和171位的蘇氨酸（Thr），第69、105、131、224、246和255位的酪氨酸（Tyr）可能會(huì)被磷酸化。同時(shí)對(duì)這些磷酸化位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的磷酸激酶進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在陸川豬IGFBP5蛋白上可能有unsp、cdc2、cdk5、GSK3、EGFR、CKII、PKG、PKA、RSK、PKC和p38MAPK等11種保守的蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，且以第115位處的unsp分值最高，為0.998。

2. 2. 7 陸川豬IGFBP5蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用NetNGlyc 1.0對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白N糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的第101和170位氨基酸處各存在1個(gè)N糖基化位點(diǎn)（圖11）;以NetOGlyc 3.1對(duì)其O糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，則發(fā)現(xiàn)陸川豬IGFBP5蛋白的第3和248位氨基酸處各存在1個(gè)O糖基化位點(diǎn)（圖12）。

2. 2. 8 陸川豬IGFBP5蛋白保守域和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用NCBI上的CDD對(duì)陸川豬IGFBP5蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白第39～315位氨基酸存在IB保守結(jié)構(gòu)域，第191～262位氨基酸存在Thyroglobulin-1保守結(jié)構(gòu)域（圖13）。應(yīng)用PSORT II中k-NN計(jì)算程序預(yù)測分析陸川豬IGFBP5蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示其分布情況為細(xì)胞核占39.1%、細(xì)胞質(zhì)占17.4%、細(xì)胞膜（包括細(xì)胞壁）占17.4%、線粒體占13.0%、細(xì)胞骨架占8.7%、囊泡占4.3%。

2. 3 陸川豬和杜洛克豬背最長肌IGFBP5基因的表達(dá)差異

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析，結(jié)果（圖14）發(fā)現(xiàn)陸川豬和杜洛克豬背最長肌中IGFBP5基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.70±0.08和1.84±0.10，二者表達(dá)差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

IGFBP5作為IGFBPs家族的成員之一，在人類和動(dòng)物的生長發(fā)育特別是肌肉生長過程中發(fā)揮重要作用，且有許多因子能調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)而影響肌肉生長（張國梁等，2011）。Soriano-Arroquia等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，miR-143的靶基因IGFBP5隨細(xì)胞的衰老而上調(diào)表達(dá)，從而影響肌細(xì)胞生成。Pan等（2017）研究表明，miR-137可通過靶向IGFBP5和調(diào)節(jié)mTOR/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。Zhang等（2017）研究表明，miR-143通過靶向IGFBP5調(diào)節(jié)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，miR-143過表達(dá)則導(dǎo)致IGFBP5蛋白水平降低，抑制細(xì)胞的增殖和分化?？梢?，IGFBP5在肌細(xì)胞的增殖分化過程中發(fā)揮重要作用，由此確定IGFBP5基因?qū)﹃懘ㄘi肌細(xì)胞增殖分化也有調(diào)控作用。本研究成功克隆獲得陸川豬IGFBP5基因可為揭示IGFBP5對(duì)陸川豬肌細(xì)胞增殖分化的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)，同時(shí)為改善陸川豬瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率等提供理論依據(jù)。

IGFBP5基因作為生長肥育性狀的候選基因，研究其在不同物種間的遺傳多態(tài)性分布，挖掘與生產(chǎn)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記為育種生產(chǎn)提供指導(dǎo)。蘆春艷等（2010）研究表明，草原紅牛IGFBP5基因第3外顯子在191 bp處存在G→A堿基突變，且該突變與宰前活重和胴體重顯著相關(guān);封利穎（2013）研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝IGFBP5基因UTR區(qū)中的C.1051A>G位點(diǎn)與其殼長、殼高、體重、軟體重及橫紋肌重顯著相關(guān);吳蘇日古嘎（2013）研究表明，IGFBP5可能與蒙古馬耐力運(yùn)動(dòng)性能及骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)。本研究克隆獲得的陸川豬IGFBP5基因CDS序列全長816 bp，與NCBI上已公布的野豬IGFBP5基因（NM_214099.1）CDS序列存在3處堿基差異，分別是：419 bp處A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第140位的組氨酸突變?yōu)榫彼幔?40His→Arg）;468 bp處A突變?yōu)門，導(dǎo)致第156位的精氨酸突變?yōu)榻z氨酸（156Arg→Ser）;533 bp處T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第178位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸（178Leu→Ser）。這3個(gè)位點(diǎn)的突變是否可作為與陸川豬胴體重、瘦肉率等性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，尚有待進(jìn)一步研究。陸川豬IGFBP5基因共編碼271個(gè)氨基酸，與NCBI上已公布各物種的IGFBP5氨基酸序列同源性均在95.2%以上，表明IGFBP5基因保守性較強(qiáng);IGFBP5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲占比最高，為65.68%;陸川豬IGFBP5蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，在第1～20位氨基酸殘基存在1個(gè)信號(hào)肽序列;蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，陸川豬IGFBP5蛋白存在2個(gè)O糖基化位點(diǎn)、2個(gè)N糖基化位點(diǎn)和多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn);亞細(xì)胞定位預(yù)測分析結(jié)果表明其可能分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁、線粒體、細(xì)胞骨架和囊泡中;陸川豬IGFBP5蛋白包含IB保守結(jié)構(gòu)域和Thyroglobulin-1保守結(jié)構(gòu)域。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)IGFBP5基因在杜洛克豬背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其在陸川豬背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量。由于IGFBP5基因在肌肉中高表達(dá)，且與肌肉增殖分化密切相關(guān)，故推測IGFBP5基因在不同豬種間的差異表達(dá)是導(dǎo)致豬肉瘦肉率差異的主要原因。

4 結(jié)論

IGFBP5基因保守性較強(qiáng)，其在不同豬種間的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致豬肉瘦肉率差異的主要原因，可作為陸川豬胴體重和瘦肉率等生長性狀的遺傳標(biāo)記予以開發(fā)利用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）