趙紅蕾,刁昱文,馮 新,高 宇,劉珊珊,顧敬敏,雷連成,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

1 概 述

近年來,抗菌藥物耐藥性成為需要緊急采取行動(dòng)的全球問題,迫切需要尋找能有效殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型抗微生物制劑或具有防御作用的新型疫苗?；谑删w展示技術(shù)的病原體抗原表位分析既是研究抗原分子的結(jié)構(gòu)和功能、抗原—抗體反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ),又可為多肽疫苗研制、藥物篩選以及特異血清學(xué)診斷方法的建立提供重要的線索和依據(jù)[1]。

噬菌體表面展示技術(shù)是Smith于 1985年首先建立起來的一種新的生物技術(shù)[2],它將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中,從而使表達(dá)的外源肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合而展示在噬菌體表面,被展示的蛋白或肽可以維持相對(duì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性[3,4]。1990年,Scott等[5]首次將隨機(jī)序列肽與絲狀噬菌體表面蛋白g融合展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。之后,噬菌體肽庫(kù)技術(shù)訊速發(fā)展,已廣泛用于抗原表位篩選、免疫學(xué)診斷、疫苗研制、藥物篩選等方面,尤其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究[6]、抗原表位分析[7]、人工抗體制備[8]、激素或病毒受體結(jié)合序列及酶的底物或抑制劑序列的確定、細(xì)胞因子拮抗劑的研制和尋找細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白等研究中發(fā)揮重要作用[9]。筆者從噬菌體展示技術(shù)的基本原理、肽庫(kù)的構(gòu)建、噬菌體肽庫(kù)的分類、噬菌體肽庫(kù)的篩選方法等方面,綜述了噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù);從抗原表位研究、免疫診斷研究、基因疫苗研究、抗菌藥物的靶向投遞等方面,闡述了噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)在分子病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用;并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望。

2 噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)

2.1 噬菌體展示技術(shù)的基本原理

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體衣殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置,在閱讀框正確且不影響其衣殼蛋白正常功能的情況下,使外源多肽或蛋白與衣殼蛋白融合表達(dá),融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫(kù)與靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后,洗去未結(jié)合的游離噬菌體及親和力較弱的噬菌體,然后以競(jìng)爭(zhēng)性受體或酸性洗脫劑洗脫與靶分子強(qiáng)力吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增,再進(jìn)行下一輪洗脫。經(jīng)過 3～5輪的“吸附—洗脫—擴(kuò)增”后,與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。而后通過測(cè)序分析可以得到多肽基序而用于下一步的疫苗研究、診斷元件構(gòu)建或其它目的[10,11]。

2.2 肽庫(kù)的構(gòu)建

噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)是由上億種與噬菌體外殼蛋白以融合的形式呈現(xiàn)在噬菌體表面的多肽所組成,庫(kù)中上億種多肽分別呈現(xiàn)在上億個(gè)噬菌體表面,眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)。構(gòu)建肽庫(kù)的關(guān)鍵是獲得足夠的獨(dú)立噬菌體克隆。以 6肽為例,至少應(yīng)獲得 107～109以上的獨(dú)立克隆。肽庫(kù)的建立基于以下事實(shí):(1)含有關(guān)鍵殘基的小肽可以模擬蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)(抗原決定簇);(2)蛋白質(zhì)之間的相互作用及識(shí)別是通過局部肽片段的相互作用實(shí)現(xiàn)的。噬菌體肽庫(kù)技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)同生物進(jìn)化理論相結(jié)合的產(chǎn)物。

在噬菌體展示隨機(jī)多肽庫(kù)的構(gòu)建策略中,大多數(shù)的肽庫(kù)是將隨機(jī)多肽片段與 pⅢ的N末端融合而展示于噬菌體表面,也有一部分肽庫(kù)采用pⅧ的N端展示。pⅢ允許展示較大的蛋白質(zhì),大至 50 ku的蛋白質(zhì)己被成功展示,其在病毒顆粒上只含有少數(shù)幾個(gè)拷貝,因而對(duì)于獲得高親和力的多肽很有好處,故pⅢ幾乎是目前所有噬菌體展示庫(kù)的骨架。而pⅧ只能融合較小的外源肽段,攜帶肽段太大會(huì)影響噬菌體粒子的組裝與感染能力,但其拷貝數(shù)高,重組噬菌體作為免疫原時(shí),可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng),在疫苗研制中應(yīng)用價(jià)值大。

目前,肽庫(kù)的構(gòu)建主要有兩種途徑:一是有機(jī)合成法,二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技術(shù),合成含有各種可能序列的短肽?；蚬こ谭椒ㄊ菍⒕幋a各種序列特定長(zhǎng)度短肽的目的基因克隆進(jìn)表達(dá)載體,與噬菌體的外殼蛋白基因融合表達(dá),使得一個(gè)噬菌體上含有一種序列的肽。目前使用的噬菌體載體大多是在pⅢ或 pⅧ基因區(qū)通過定點(diǎn)突變引入適宜的酶切克隆位點(diǎn),同時(shí)在其下游插入抗生素抗性基因和包含復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA片段構(gòu)建而成。

2.3 噬菌體肽庫(kù)的分類

噬菌體肽庫(kù)依據(jù)外源融合多肽的構(gòu)象是否被限制,可分為兩類:一類為展示于噬菌體表面的多肽,其構(gòu)象不受限制,即沒有束縛其外源融合多肽構(gòu)象的二硫鍵存在,呈線性狀態(tài);另一類為構(gòu)象限制的肽庫(kù),其特點(diǎn)是外源隨機(jī)肽兩側(cè)各有一個(gè) Cys殘基,在噬菌體表面形成二硫鍵,它與受體的親和力比線性肽庫(kù)要高。在篩選受體的相應(yīng)配基時(shí),使用構(gòu)象限制性肽庫(kù)比使用完全隨機(jī)肽庫(kù)更容易獲得成功。另外,噬菌體肽庫(kù)依據(jù)展示于噬菌體外膜上外源融合多肽的拷貝多少形式的不同,可相應(yīng)地分為單價(jià)多肽噬菌體庫(kù)和多價(jià)多肽噬菌體庫(kù)。目前,根據(jù)噬菌體載體的不同,噬菌體展示系統(tǒng)主要分為:絲狀噬菌體系統(tǒng)、λ噬菌體系統(tǒng)、T4噬菌體系統(tǒng)以及T7噬菌體系統(tǒng)。

2.4 噬菌體肽庫(kù)的篩選方法

目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的噬菌體展示肽庫(kù)篩選方法有很多種,如:固相純化抗原篩選、液相篩選法(磁珠篩選)、全細(xì)胞篩選、動(dòng)物體內(nèi)篩選、血清篩選等。能否從肽庫(kù)中篩到特異性強(qiáng)的噬菌體克隆受到多個(gè)因素的影響,其中,篩選方法的合理應(yīng)用在很大程度上起著決定性作用。

2.4.1 固相篩選法 固相純化抗原篩選最早的辦法是用抗原包被 ELISA板,方法與常規(guī)的ELISA方法相似,但抗原濃度要適當(dāng)提高。近年來,不斷有文獻(xiàn)報(bào)道通過改進(jìn)固相篩選方法取得了很好的效果[12,13]。

固相篩選法操作簡(jiǎn)單,篩選出陽(yáng)性克隆的幾率高,但需要純化大量的靶蛋白純品,而且不易根據(jù)抗體庫(kù)和抗原的性質(zhì)進(jìn)行量化處理,因而針對(duì)抗體的親和力有所選擇時(shí)此法效果欠佳。同時(shí),固相篩選出的抗體有時(shí)不能與天然抗原結(jié)合,并且要求抗體庫(kù)的庫(kù)容量較大。

2.4.2 液相篩選法 液相篩選法將抗原用生物素標(biāo)記后在液相中利用鏈親和素磁珠借助磁場(chǎng)的作用進(jìn)行多肽噬菌體篩選。其優(yōu)點(diǎn)是增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的幾率,提高了篩選效率;篩選體系可以根據(jù)抗體庫(kù)的庫(kù)容、抗原的相對(duì)分子量和純度等對(duì)篩選體系進(jìn)行調(diào)整;可預(yù)先確定所期望抗體的親和力,選擇性地篩選到不同親和力的噬菌體抗體[14]。但是液相篩選獲得的克隆特異性比較差。

2.4.3 體內(nèi)篩選法 體內(nèi)篩選方法將常規(guī)的噬菌體展示技術(shù)與動(dòng)物荷瘤模型相結(jié)合,進(jìn)行腫瘤或其內(nèi)部血管上特定配體的篩選。體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)除了具備常規(guī)的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)快速、高效的特性外,還因?yàn)樵摵Y選過程主要在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行,能夠充分模擬人體內(nèi)環(huán)境,并最大程度地保持感興趣組織或細(xì)胞上各種配體的天然構(gòu)象,可以較好地評(píng)價(jià)目標(biāo)篩選物親和吸附的特異性及偶聯(lián)藥物后的臨床效果[15]。但是體內(nèi)篩選的特異性較差,容易篩得與血管壁或成纖維細(xì)胞等其他非特異性的噬菌體。而且,體內(nèi)篩選周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜,容易出現(xiàn)噬菌體序列的丟失。

2.4.4 全細(xì)胞篩選法 全細(xì)胞篩選可以獲得針對(duì)細(xì)胞膜表面分子的特異性多肽,而且細(xì)胞膜表面分子以天然狀態(tài)存在,應(yīng)用此方法篩選更容易獲得有功能的小肽[16]。并且全細(xì)胞篩選具有簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn),在篩選過程中試驗(yàn)條件可控性強(qiáng)、影響因素小,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性高,是最常用的方法。但是細(xì)胞表面的目的蛋白含量較低,蛋白成分復(fù)雜,篩選的難度很大。

不同的篩選方法各具優(yōu)勢(shì),在實(shí)際的篩選過程中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)抗體庫(kù)的庫(kù)容、抗原的性質(zhì)和純度、篩選的目的,合理地選擇篩選方法,從而獲得更有效的結(jié)果。

3 噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)在分子病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用

近年來,噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)不斷被改進(jìn)和完善,在生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,在分子病原細(xì)菌學(xué)方面的應(yīng)用主要表現(xiàn)在抗原表位篩選[5,17]、免疫學(xué)診斷[18～20]、疫苗研制、藥物篩選及靶向投遞[16]等方面。

3.1 抗原表位研究

抗原表位是抗原分子中與抗體或致敏的淋巴細(xì)胞結(jié)合的部位,有線性表位和構(gòu)象型表位兩種類型,線性表位的氨基酸序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的,而構(gòu)象型表位是由一級(jí)結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的氨基酸殘基經(jīng)過肽鏈折疊而在空間聚集在一起形成的一定的空間結(jié)構(gòu)。在完整蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗血清中,抗構(gòu)象型表位的抗體占 90%,只有 10%的抗線性表位抗體。

傳統(tǒng)的抗原表位分析主要是通過分析抗原經(jīng)物理化學(xué)降解得到的片段或人工合成一系列來源于抗原的肽段與相關(guān)抗體的結(jié)合活性而得到,此方法成本高,必須首先確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列,才能合成相應(yīng)的肽,而在實(shí)際研究中,許多蛋白質(zhì)的序列并不清楚。此外,由于表位多數(shù)情況下為包含結(jié)合受體所必需的某些氨基酸不連續(xù)的空間構(gòu)象,僅少數(shù)為一段連續(xù)的線性氨基酸殘基,因此線性的合成肽僅能模擬蛋白質(zhì)的線性表位,無疑會(huì)丟失眾多的構(gòu)象型表位信息。

噬菌體肽庫(kù)技術(shù)將抗體作為受體暴露于肽庫(kù)中篩選到能與特異性抗體相結(jié)合的重組噬菌體肽的序列,彌補(bǔ)了合成肽篩選的不足。噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)研究分析抗體所識(shí)別的抗原表位具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)噬菌體多肽易生產(chǎn)和分離,價(jià)廉;(2)噬菌體穩(wěn)定且保存時(shí)間長(zhǎng);(3)可進(jìn)一步改造以滿足不同的需要;(4)噬菌體具有免疫原性,因而作為疫苗免疫時(shí)無需佐劑;(5)提供了一種快速鑒定免疫優(yōu)勢(shì)中和抗原決定簇的有效方法。

目前,以純化的單抗為靶標(biāo)篩選抗原模擬表位的應(yīng)用最廣泛也最為成熟,為在未知條件下分離病原體的表位,或作為診斷試劑提供了廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)外學(xué)者已成功地篩選到不連續(xù)的與原始抗原沒有同源性的乙肝病毒(HBV)[21]、丙肝病毒(HCV)[22]、人類免疫缺陷病毒(HIV)gp 120蛋白[23]的模擬表位序列,這些序列均具有很強(qiáng)的免疫原性,不需要添加任何佐劑,所激發(fā)的抗體既能識(shí)別模擬表位抗原也能識(shí)別原始抗原。這些模擬表位抗原可以避免完整抗原的毒性作用并可以避免產(chǎn)生不需要的非中和抗體。同時(shí)利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)還可以模擬一些半抗原和不具有免疫原性的物質(zhì),從而研制一些模擬肽藥物,如對(duì)肺炎球菌等一些細(xì)菌疫苗的研制都從模擬肽入手獲得了一定突破[24]。郭奕陽(yáng)等[25]借助基因工程手段獲取了含有McAb2相應(yīng)表位的融合蛋白及預(yù)期表位缺失蛋白,并利用噬菌體肽庫(kù)篩選 McAb2結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),進(jìn)而對(duì)該結(jié)合位點(diǎn)是否與 FH和 Fba蛋白的結(jié)合位點(diǎn)相重疊進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步探索 Fba蛋白在GAS致病機(jī)制中的作用,鑒定 McAb2的功能及制備表位肽疫苗奠定了基礎(chǔ)。李妍等[26]通過利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選出 THp主要保護(hù)性抗原UreaseB,Lpp20,Catalase的B細(xì)胞表位,從而初步建立了Hp主要保護(hù)性抗原 B細(xì)胞表位鑒定的研究平臺(tái),為Hp表位疫苗的研制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

3.2 免疫診斷研究

感染性疾病患者血清中含有針對(duì)抗原的各種抗體,但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表達(dá)的情況下才容易獲得純抗原來鑒定特異性的抗體,而利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選到的小肽分子可以和患者體內(nèi)的抗體相結(jié)合,從而發(fā)現(xiàn)患者血清中的特異抗體,可由此用于快速、特異性地診斷疾病。

Nathan等[27]構(gòu)建了 1個(gè)針對(duì)熱帶病原菌(類鼻疽桿菌屬)的人鼠嵌合抗體 Fab庫(kù),并利用此庫(kù)篩選出針對(duì)蛋白酶的克隆,分析了其作為蛋白酶抑制劑的功能。體外實(shí)驗(yàn)證明,純化的 Fab有抑制該蛋白酶的能力,并對(duì)致病性蛋白酶有專屬性。Saldarelli等[28]應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)建立了人源重組抗體庫(kù),從中獲得 15株對(duì)B型葡萄病毒有特異性的重組ScFv抗體。其中 2株的編碼基因在重組中以二聚體形式表達(dá),用該二聚體ScFv抗體成功地在草本植物,葡萄樹的組織中直接檢出了 B型葡萄病毒,該抗體被認(rèn)為可有效代替 B型葡萄病毒的多克隆血清,建立新的 DAS ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),用于常規(guī)診斷。

3.3 基因疫苗研究

運(yùn)用肽庫(kù)的最大優(yōu)點(diǎn)是不需要靶蛋白的任何結(jié)構(gòu),只需利用其抗體或受體來捕獲噬菌體肽庫(kù)中的小配體,并可大量繁殖,這為疫苗的設(shè)計(jì)生產(chǎn)提供了極大方便。利用噬菌體展示肽庫(kù)親和淘篩可以得到一些抗原的模擬表位,這些模擬抗原除了能模擬天然抗原的結(jié)構(gòu)外,還具有一定的免疫原性,能像天然抗原一樣刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng),由它產(chǎn)生的抗體能與真正病原體上的天然表位反應(yīng),這有利于將發(fā)現(xiàn)的表位作為人工合成疫苗的一個(gè)組分,在疫苗設(shè)計(jì)方面有著廣泛的應(yīng)用前景[29]。

非典型嗜血流感桿菌(NTHi)是導(dǎo)致兒童中耳炎和成人下呼吸道疾病的常見原因。到目前為止,尚無有效的疫苗來防治。NTHi的一個(gè)主要表面蛋白混合寡糖(LOS)是重要的毒力因子。LOS毒力很強(qiáng),以致于在體內(nèi)很難被控制,但是去毒的 LOS是不依賴于T細(xì)胞的小分子,而且在體內(nèi)的免疫原弱。Hou等[30]將噬菌體展示 12肽庫(kù)與抗 NTHi LOS的兔抗體反應(yīng),以期得到模擬LOS抗原。結(jié)果表明,得到的合成肽使兔產(chǎn)生了一定的抗NTHi LOS能力。

3.4 抗菌藥物的靶向投遞

傳統(tǒng)的新藥開發(fā),由于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系不夠了解,只能通過大規(guī)模的定點(diǎn)突變和費(fèi)時(shí)的單個(gè)目的蛋白的克隆表達(dá)純化與篩選來修飾現(xiàn)有蛋白。

隨著人類對(duì)細(xì)胞認(rèn)識(shí)的不斷深入,人們更多從分子水平來闡述細(xì)胞間的作用機(jī)制[31]。已經(jīng)明確,受體是細(xì)胞同外界聯(lián)系的通道,各種生物因子(包括某些藥物)都是通過同受體結(jié)合而產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。而噬菌體展示肽技術(shù)只要以一定功能的靶分子為受體,在天然蛋白質(zhì)或特定功能的框架分子噬菌體展示文庫(kù)中篩選配體,就可以簡(jiǎn)便快速地獲得與靶分子具有強(qiáng)親和力和特異性的小肽或新型蛋白,可作為受體的激動(dòng)劑或拮抗劑[32],分析其結(jié)構(gòu)就可以合成相應(yīng)的藥物,作為候選藥物或用于抗菌藥物的靶向投遞。

噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)用于病原菌導(dǎo)向治療研究主要集中在 3個(gè)方面:①篩選病原菌抗原表位特異性結(jié)合肽,與藥物耦聯(lián)后用于病原菌的藥物靶向投遞和治療;②篩選與病原菌致病性相關(guān)蛋白的結(jié)合肽,為病原菌免疫診斷提供了一個(gè)有前途的方法;③篩選病原菌相關(guān)抗原表位和蛋白結(jié)合肽后與基因耦聯(lián),用于藥基因疫苗設(shè)計(jì)和基因治療。

4 問題與展望

噬菌體肽庫(kù)對(duì)于連續(xù)、不連續(xù)的或非肽表位(即糖蛋白)都具有良好的篩選作用,是研究復(fù)雜生物系統(tǒng)有用的工具。通過篩選得到的生物活性肽是構(gòu)建“生物導(dǎo)彈”的基礎(chǔ),至今據(jù)報(bào)道建立在這種基礎(chǔ)上的腫瘤導(dǎo)向治療表現(xiàn)出高效性和高安全性,其在病原細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用也越來越受國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注。

當(dāng)然需要指出的是,噬菌體的建庫(kù)過程仍然依賴于 DNA的轉(zhuǎn)化,因而實(shí)際存在的肽庫(kù)的多樣性是有限的。肽本身的單一性也限制了對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)分子的研究。而且篩選到的具有高親和力的生物活性肽與抗微生物藥物結(jié)合必須以不改變兩者特異性為前提,在結(jié)合后也應(yīng)以病原體抗原表位為靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確地導(dǎo)向殺傷。雖然這樣,我們?nèi)匀豢梢杂秒S機(jī)肽庫(kù)篩選出的新的配體成為基因或藥物傳遞治療的載體,為病原菌治療開辟一條新途徑。

總之,噬菌體肽庫(kù)是噬菌體展示技術(shù)在近些年來發(fā)展起來的重要分支,其具有高庫(kù)容、高效方便及靈活的篩選技術(shù)等特點(diǎn),使其在許多方面如功能基因組學(xué)、藥物設(shè)計(jì)和尋找新配體等占有重要地位。隨著篩選靶標(biāo)范圍的擴(kuò)展及相應(yīng)的更加完善的篩選方法的建立,噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)必將為生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展,尤其是病原菌方面的研究和應(yīng)用帶來巨大的推動(dòng)。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)