刁昱文,趙紅蕾,高 宇,劉珊珊,馮 新,雷連成,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

自從青霉素發(fā)現(xiàn)以來,抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器,但是由于人類對抗生素的持續(xù)使用和濫用,導(dǎo)致很多細(xì)菌和病毒對現(xiàn)有的抗生素都產(chǎn)生了耐藥性。NDM-1超級細(xì)菌的出現(xiàn),更是引起了世界對病菌耐藥性問題的極大重視乃至恐慌[1]。歐洲專家預(yù)計(jì),至少 10年內(nèi)沒有抗生素可以有效對付這種細(xì)菌,因此呼吁全球密切監(jiān)控阻止超級細(xì)菌傳播,更迫切的需要尋找具有全新機(jī)制殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型微生物制劑。

1 抗菌肽概述

1950年在弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素的同時(shí),在血細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了具有廣譜抗菌活性物質(zhì)的存在[2]。隨后在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了可以對感染發(fā)生作用的細(xì)胞內(nèi)的陽離子抗菌肽,其作用與昆蟲的先天免疫細(xì)胞相同[3,4]。1974年,瑞典科學(xué)家G.Boman等向眉紋天蠶蛾(Sam ia Cynthia)蛹注入大腸桿菌后,在血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿性多肽類物質(zhì),隨后誘導(dǎo)惜古比天蠶(Hyalophra Cecropia)蛹也發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)[5,6]。1981年,這種具有抗菌活性的物質(zhì)被命名為 cecropin[7],這是人們第一次真正意義上發(fā)現(xiàn)抗菌肽。1983年 Lehrer和Selsted從兔的肺巨噬細(xì)胞中純化出兩種抗菌肽,隨后被命名為defensins[8]。在隨后的研究中,從哺乳動物、兩棲類、魚類、昆蟲類、鳥類和植物中均發(fā)現(xiàn)了抗菌肽[9～13]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其分子量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌高效廣譜,抗菌機(jī)理不同于抗生素,對真核細(xì)胞幾乎沒有作用,僅作用于原核細(xì)胞,同時(shí)不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,而且對真菌、病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞有一定殺傷作用,具備新型藥物開發(fā)的巨大潛力[15～17],據(jù)最新統(tǒng)計(jì),在線數(shù)據(jù)庫中(http://aps.unmc.edu/AP/main.phe.)已有 2 000多種不同來源的抗菌肽被收錄。

抗菌肽根據(jù)內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和氨基酸不同可分為α螺旋蛋白類、富含色氨酸的 AMPs、含有二硫鍵的 AMPs、富含脯氨酸的昆蟲抗菌肽、Cationic peptide-antisense oligonucleotide Hybrids、陽離子多肽的抗菌擬肽、乳酸桿菌和鏈球菌產(chǎn)生的抗菌肽、多粘菌素[18～20]。

2 抗菌肽的主要研究熱點(diǎn)及發(fā)展趨勢

2.1 新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與鑒別

發(fā)現(xiàn)并鑒定新型抗菌肽仍是國內(nèi)外研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著研究水平的不斷提高,新型抗菌肽發(fā)現(xiàn)的速度與數(shù)量與日俱增。目前分離鑒定最直接的方法是通過給予待測生物特定的刺激或不刺激,收集分泌物,以蛋白純化方法直接分離,通過質(zhì)譜鑒定。將蛋白質(zhì)組學(xué)和肽組學(xué)技術(shù)運(yùn)用到抗菌肽的分離與鑒定,是獲得新的抗菌肽的更為可取的方法。構(gòu)建皮膚組織的 cDNA文庫,結(jié)合特定的篩選策略,高通量的篩選特定種類的多肽全長的 cDNA編碼序列,通過基因工程方法進(jìn)行表達(dá)或人工合成來獲得純的抗菌肽進(jìn)行生物學(xué)活性研究。

僅在 20世紀(jì)70～90年代,歐洲、美洲、非洲、澳洲的研究者們就對其本土的兩棲類動物皮膚分泌液中的活性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了大規(guī)模的調(diào)查研究和開發(fā)利用工作,發(fā)現(xiàn)了上百種的兩棲類動物皮膚活性多肽。中國科學(xué)院昆明動物所的賴仞等從單個(gè)無指盤臭蛙克隆得到了 372條抗菌肽序列,他們編碼 107條新的抗菌肽,分別屬于 30個(gè)不同的抗菌肽家族。這一發(fā)現(xiàn)使得目前發(fā)現(xiàn)的兩棲類抗菌肽數(shù)目增加了 2倍 。

2010年,Mechkarska等從去甲腎上腺素刺激負(fù)子蟾科非洲爪蛙的皮膚分泌物中,分離鑒定出 9種具有抗菌活性的抗菌肽,其中,1個(gè)多肽是 magainin-2的同源類似物,2個(gè)是 PGLa的同源類似物,1個(gè)雨蛙肽前體,1個(gè)爪蟾肽前體,4個(gè) CPF等。研究顯示對 Escherichia coli和 Staphylococcus aureus均有抑菌活性[22]。

本研究室以牛蛙皮膚中提取的mRNA為材料,構(gòu)建牛蛙皮膚 cDNA文庫。利用 PCR方法對文庫進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn) 6個(gè)新抗菌肽序列,根據(jù)序列特征可分為 3個(gè)家族:Catesbeianin-1,Ranacyclin,Temporin。對新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽進(jìn)行了生物學(xué)活性測定,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Temporin對革蘭氏陽性菌有著很好的殺菌作用[23]。

2.2 抗菌肽的設(shè)計(jì)

抗菌肽分子設(shè)計(jì)是一個(gè)相當(dāng)活躍的領(lǐng)域,多學(xué)科交叉在這里得到了充分體現(xiàn)。伴隨每一種新抗菌肽的發(fā)現(xiàn),都會進(jìn)行氨基酸序列的修飾,目的是尋找對抗菌活性影響的關(guān)鍵部位,并進(jìn)一步進(jìn)行分子設(shè)計(jì),以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。對天然抗菌肽進(jìn)行序列修飾包括以下內(nèi)容,即增加、刪除、或替代 1個(gè)或多個(gè)殘基,截取肽鏈N端或C端部分序列,連接不同自然來源的抗菌肽片段成為雜合肽等。

2.2.1 靶向性抗菌肽的設(shè)計(jì) 在對抗菌肽的抗菌活性研究的同時(shí),有研究者注意到,一些抗菌肽在治療黏膜感染時(shí),并不能對有益菌群和致病菌群進(jìn)行選擇性殺傷,有益菌群的破壞,很有可能導(dǎo)致二次感染。靶向性抗菌肽的設(shè)計(jì),可以只對致病菌進(jìn)行殺傷,從而維持正常菌群的生長。

Steven A等設(shè)計(jì)了一個(gè)含有固定環(huán)狀抗菌肽,基于穩(wěn)定的胱氨酸 β折疊股框架,這個(gè)框架模擬可能的 LPS結(jié)合位點(diǎn),對革蘭氏陰性細(xì)菌 E.coli在抗菌肽最低濃度 20 nmol/L時(shí),有著有效的殺菌效果,選擇效果高于革蘭氏陽性細(xì)菌S.aureus 200倍[24]。

Eckert等通過化學(xué)合成法,將沒有殺滅門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)能力的特異性靶向定位區(qū)域(KH)與廣譜 AMP(novinspirin G10)融合,合成了能選擇性地殺滅門多薩假單胞菌的G10KHc。G10KHc的靶向定位能力由KH分子與細(xì)菌的選擇性結(jié)合引起,說明KH選擇性地傳遞G 10KHc至門多薩假單胞菌表面后,AMP區(qū)域快速破壞外膜,增強(qiáng)穿透細(xì)胞質(zhì)膜的能力引起細(xì)胞死亡[25]。

在 Eckert研究基礎(chǔ)上,He等設(shè)計(jì)并合成了具有雙靶點(diǎn)特意性的AMM8(KH)-20。體外實(shí)驗(yàn)表明,M8(KH)-20可以對門多薩假單胞菌和變異鏈球菌(Streptococcusmutans)有著特異性靶向殺滅作用,并對共同培養(yǎng)的其它非靶向病原菌的影響較小[26]。

2.2.2 生物信息序列分析 伴隨著生物軟件和相關(guān)網(wǎng)站的發(fā)展,運(yùn)用生物信息學(xué)手段對抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、功能預(yù)測和新序列設(shè)計(jì)已經(jīng)成為生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)交叉運(yùn)用的熱點(diǎn)。

將化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合應(yīng)用,可以進(jìn)行新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)、抗菌肽的功能預(yù)測、方法分析,對在線搜索結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)和對比,還可以進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析。網(wǎng)站有http://www.expery.Org等,軟件有 Accelrys公司的 Insight II三維圖形環(huán)境軟件包。免費(fèi)軟件:蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT,DNASTAR等包括了蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域所包括的大多數(shù)內(nèi)容,功能非常強(qiáng)大,能進(jìn)行各種蛋白序列分析與特性預(yù)測。

Sarah R等應(yīng)用聚類分析的方法,對具有抗腫瘤活性的抗菌肽,按照靜電荷數(shù)目,平均疏水力矩和平均疏水性 3個(gè)參數(shù)進(jìn)行了聚類分析。經(jīng)過分析得出,疏水性是抗菌肽進(jìn)行穿膜的關(guān)鍵因素[27]。

孫雁霞等對 defensin抗菌肽進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。一級結(jié)構(gòu)表明其具有典型的昆蟲防御素特征。二級結(jié)構(gòu)分析表明 defensin抗菌肽中主要的結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋。通過對不同物種 defensin抗菌肽的分析結(jié)果表明,非陽離子抗菌肽的作用機(jī)制可能是疏水作用力起主導(dǎo)作用,或者是與細(xì)菌胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)菌胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響有關(guān)[28]。

Tossi等自建的數(shù)據(jù)庫廣泛收集了 800多條抗菌肽,這些抗菌肽中基于不同的生物來源,能形成兩親α-螺旋的有 150多條。將其 N端 20個(gè)氨基酸殘基根據(jù)不同類型(電性、極性、螺旋穩(wěn)定性等)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得出了序列模板:ghhp+hxpxh+phh+xhhxh[29]。Tiozzo等以該序列模板為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)出類似于哺乳動物中抗菌肽 cathelicidin家族的新型肽 PGY a(PGY a:G LLRRLRDF LKKIGEKFKKIGY-NH 2)[30]。在此基礎(chǔ)上,G iangaspero等用這個(gè)模板研究物理化學(xué)參數(shù)對活性的影響,通過序列變化合成了 20條肽鏈,得到了一系列具有參考價(jià)值的結(jié)論,這在某種程度上對多樣性抗菌序列進(jìn)行了一個(gè)總結(jié),為單獨(dú)對個(gè)別肽鏈進(jìn)行分子設(shè)計(jì)提供了參考[31]。

2.3 抗菌肽在先天性免疫中的作用

先天性免疫是提供給有機(jī)體對抗致病微生物侵襲的快速的第一道防線。由于抗菌肽可以對多種致病微生物快速發(fā)揮功能,所以宿主來源的抗菌肽一直被認(rèn)為是機(jī)體的“天然抗生素”,其特點(diǎn)是來源多樣,并且參與先天性免疫的各個(gè)環(huán)節(jié)而成為新的治療藥物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)[14,32～33]。

Territo等[34]首次證明,α-defensins是人類單核細(xì)胞的趨化因子。Scott等[35]發(fā)現(xiàn)了可以選擇性地調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)的抗菌肽。Scott設(shè)計(jì)的13個(gè)氨基酸的非毒性多肽IDR-1(KSRIVPAIPVSLL-NH 2)可以減弱促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,同時(shí)促進(jìn)單核細(xì)胞的選擇性聚集,增強(qiáng)和維持單核巨噬細(xì)胞炎癥趨化因子水平。

感染或損傷處所分泌的Cathelicidins和defensins對效應(yīng)細(xì)胞具有趨化性,誘導(dǎo)化學(xué)激活素的轉(zhuǎn)錄及分泌和肥大細(xì)胞的組胺釋放,這些反應(yīng)共同促進(jìn)先天的及獲得性免疫細(xì)胞的補(bǔ)充。Cathelicidin家族的抗菌肽能夠抑制致炎細(xì)胞因子如TNF-α,IFN-r和 IL-6的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、促炎癥反應(yīng)物質(zhì)的釋放及避免細(xì)菌感染后嚙齒類的膿毒癥,還能防止引起組織損傷和炎癥的毒性組分的產(chǎn)生,Cathelicidin家族抗菌肽還可通過調(diào)節(jié)TLR 4來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[36]。

2.4 抗菌肽藥物的開發(fā)利用

2.4.1 抗菌肽在人類疾病和健康的臨床應(yīng)用 目前,人類醫(yī)學(xué)上抗菌肽的研究主要針對皮膚疾病、呼吸性疾病、腸疾病等一些炎性疾病和由致病微生物所引起的感染性疾病。同時(shí),抗菌肽的抗腫瘤活性也已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和關(guān)注。

在哺乳動物和人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽在人體中主要起的兩個(gè)作用已被證實(shí),一是直接的殺菌特性,二是免疫調(diào)節(jié)特性。應(yīng)用比較多的兩種抗菌肽是Cathelicidin和 defensins,它們的抗菌活性和多向的在感染和炎癥疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用已被證實(shí)。通過具有針對性和系統(tǒng)性的路線進(jìn)行刺激誘導(dǎo)性給藥而激發(fā)內(nèi)源性抗菌肽,是一種安全的成本低廉的治療方案。同時(shí)還避免了合成類似物所產(chǎn)生的副作用和藥物在體內(nèi)靶向傳遞的困難[37]。

有研究者發(fā)現(xiàn),在皮膚上Cathelicidin對A型鏈球菌有著明顯的抗菌作用,但是在體外實(shí)驗(yàn)中對大腸桿菌 B型鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力有所降低[38]。α-defensins HNP-1,HNP-2,HNP-3在體外對腺病毒有著很強(qiáng)的抗病毒活性,并且對皰疹病毒、流感病毒和巨細(xì)胞病毒均有抑制活性;HNP-4對H IV-1感染也有一定的抑制作用[39]。更多的研究發(fā)現(xiàn) β-defensins,以對抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的感染。另有研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核桿菌感染的人肺泡巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo) HBD-2的表達(dá),說明 HBD-2在人類結(jié)核病的感染中起到一定作用[40]。

抗菌肽已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在特異性皮炎和銀屑病這兩種皮膚疾病的治療中。通過服用 VD3來誘導(dǎo)體內(nèi) LL-37的表達(dá),使用有益菌種或是丁酸鈉來誘導(dǎo)腸內(nèi)抗菌肽的抗感染和抗炎能力[41]。

抗菌肽可能成為一種新型的藥物載體。兩親性抗菌肽的膜穿透性是其作為藥物運(yùn)輸載體的基礎(chǔ),Laszlo Otvos等將分子量小且富含精氨酸殘基的昆蟲抗菌肽 pyrrochoricin和其衍生物作為施藥運(yùn)載工具,可將抗原性較弱的 9個(gè)殘基的MHC-1的抗原表位遞送到小鼠體內(nèi),產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞毒性 T細(xì)胞反應(yīng),證實(shí)pyrrochoricin同系物具有運(yùn)載抗原依賴性疫苗的潛力[42]。Magainin與溶于體積分?jǐn)?shù)為 0.50的乙醇的表面活性劑增強(qiáng)劑 N-月桂酰肌氨酸一起可以破壞皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)結(jié)構(gòu),從而增加了藥物的皮膚透過性,該結(jié)果顯示出抗菌肽作為透皮給藥載體具有很好的發(fā)展前景[43],進(jìn)一步探討抗菌肽作為穿膜肽的應(yīng)用具有廣闊的前景。

抗菌肽的抗腫瘤活性為腫瘤藥物的開發(fā)提供了又一個(gè)研究平臺。已經(jīng)證實(shí)天蠶素A和B,LL-37/hCAP-18,Magainins,Gaegurins,Aurein 1.2,Citropin 1.1,Melittin(蜂毒肽),Lactoferrici,Tachyp lesin I(鱟素 I),cathelicidin家族中的 PR-39以及一些人工合成的AMPs等有著很好的抗腫瘤活性。在研究AMPs抗腫瘤的同時(shí),研究者通過其對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制和對 AMPs本身的改造,使某些抗腫瘤AMPs不僅在抗腫瘤活性上得到提高,并大大增強(qiáng)了 AMPs對腫瘤細(xì)胞的靶向性[15]。

雖然始終有大量的研究人員在對天然抗菌肽提取、純化、結(jié)構(gòu)驗(yàn)證和改造等各方面不斷地做出成績,但是只有一小部分多肽進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。幾個(gè)很有希望的品種在進(jìn)行三期臨床試驗(yàn)階段宣告失敗。比如MSI-78,臨床實(shí)驗(yàn)是用于治療糖尿病性足潰瘍感染,其療效等同于口服氧氟沙星。同樣在臨床三期就宣告失敗的還有 IB-367和 MBI-226。到目前為止還沒有任何抗菌肽或其衍生物被FDA批準(zhǔn)上市,多是用作食品添加劑、獸藥。所以研發(fā)抗菌肽類藥物還有很長的路要走。目前很多知名藥物研發(fā)機(jī)構(gòu),如Micrologix仍然對抗菌肽類藥物進(jìn)行著不懈地探索。其中用于治療過敏性痤瘡的多肽類藥物已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)階段,用于治療 MRSA引起的鼻腔炎癥也進(jìn)入Ⅰb期臨床實(shí)驗(yàn)階段。

2.4.2 代抗生素添加劑 根據(jù)美國相關(guān)科學(xué)家聯(lián)盟的一項(xiàng)研究表明,美國 70%的抗生素應(yīng)用于健康的動物,用來增加健康畜禽的體重。2010年 6月 28日,美國食品及藥品管理局(FDA)實(shí)施了進(jìn)一步限制抗生素在動物生產(chǎn)上的措施,主要是因?yàn)樵趧游镲暳现谐Ｒ?guī)使用抗生素導(dǎo)致出現(xiàn)抗藥性的新細(xì)菌菌株。動物食品安全有賴于生產(chǎn)過程的各個(gè)環(huán)節(jié),使用無污染、在動物體內(nèi)無殘留、無毒副作用的添加劑是解決問題的關(guān)鍵之一。

抗菌肽是動物體成分之一,參與生命過程是小分子短肽具有安全無毒副作用的生物學(xué)特性?？咕谋姸嗟膬?yōu)點(diǎn)為其在獸醫(yī)學(xué)和飼料科學(xué)中的應(yīng)用指明了作為可代替抗生素的應(yīng)用方向,尤其是抗菌肽分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng),因此可以耐受飼料制粒時(shí)的高溫,規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)時(shí),經(jīng)高溫濃縮工序,可充分殺滅酵母菌體而不導(dǎo)致抗菌肽失活,產(chǎn)品在推廣應(yīng)用后不會出現(xiàn)工程菌的擴(kuò)散而導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問題。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)