高 宇,馮 新,李林溪,趙紅蕾,刁昱文,劉珊珊,顧敬敏,韓文瑜,雷連成

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春,130062)

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)又名奶牛乳腺炎,是奶牛乳腺常見發(fā)生的一種炎癥,由多種因素引起,在奶牛群中的發(fā)病率有上升的趨勢,嚴重影響奶牛業(yè)的發(fā)展,至今尚未有徹底解決的辦法。在我國每年用于治療奶牛乳房炎的費用近億元人民幣,由此可見,乳房炎對奶牛業(yè)的危害是巨大的。奶牛乳房炎發(fā)生原因眾多,包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、支原體、霉形體還有病毒等等。病原體感染和環(huán)境等其他因素的影響都不可忽視?？刂迫榉垦椎陌l(fā)生,其關鍵問題就是做好預防和治療,還要定期對牛群進行乳房炎的排查,以消除其潛在的隱患。因此,疫苗的開發(fā)在防治奶牛乳房炎方面顯得尤為重要。

實踐證明,利用疫苗控制奶牛乳房炎發(fā)生是可行的。首先,奶牛乳房炎是因乳腺組織感染病原微生物所致,且以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌為主,占整個乳腺炎病例的 90%以上。其次,利用疫苗控制乳房炎具有無乳汁殘留、降低乳腺感染的嚴重程度、控制隱性乳房炎的發(fā)生、操作簡便、費用低廉等優(yōu)點。本研究主要從金黃色葡萄球菌苗、大腸桿菌苗、鏈球菌苗和多聯(lián)苗幾方面闡述疫苗防治在奶牛乳房炎研究中的應用,為奶牛乳房炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 金黃色葡萄球菌苗

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶,故致病性強[1]。

Karakawa和Vann首次報道了金黃色葡萄球菌莢膜有 8個血清型,Sompolinsky等[2]將其擴展為 11個。據(jù)報道從美國和歐洲乳房炎乳汁分離的金黃色葡萄球菌中 100%和 98%金黃色葡萄球菌的血清型為 5型、8型和 336型,并且 94%～100%有莢膜多糖,莢膜多糖具有抗吞噬活性且阻止中性粒細胞識別抗金黃色葡萄球菌細胞壁成分的抗體[3]。

1.1 現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌苗

目前,研制的金黃色葡萄球菌菌苗或類毒素已用于金黃色葡萄球菌性乳房炎的防治中,試驗結果表明,不論是滅活苗,還是活苗,都能提高奶牛自發(fā)性治愈率,降低臨床型乳房炎的發(fā)生率,且活苗免疫后的血清抗體效價明顯高于滅活苗。

Pankey等[4]利用多種噬菌體型的金黃色葡萄球菌裂解物研制的疫苗,發(fā)現(xiàn)可提高臨床型乳房炎的自愈率,但對降低乳腺內再感染效果并不確實。應用 3種噬菌體型金黃色葡萄球菌與α及β毒素組成的疫苗免疫奶牛,結果表明,該疫苗可以降低奶牛乳房炎發(fā)生率,卻不能提高自愈率,不能提供有效的保護。

核糖體是一種胞漿顆粒。用核糖體制備菌苗對金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染都具有防御作用,可誘導交叉血清型保護,并具有毒性小、效力強等優(yōu)點,該菌苗已經(jīng)被推廣到生產(chǎn)實踐中,起到了很好的免疫效果。MASTIVACⅠ是從臨床和亞臨床奶牛乳房炎病例中分離的含有3種血清型金黃色葡萄球菌(VLVL8407,ZO3984和BS449)的滅活苗。LeitneraG等[5]試驗證明,這種疫苗對金黃色葡萄球菌性乳房炎有較強防御作用。Lubashevsy B等[6]采用 452頭荷斯坦奶牛試驗證明了 MASTIVACⅠ疫苗能夠非特異性的改善乳腺健康狀況,使產(chǎn)奶量明顯增加。

Wubshet等[7]報道,含金黃色葡萄球菌纖維素結合蛋白 (FnBP)的血清對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎有調理作用。Lulzim Shkreta等[8]對金黃色葡萄球菌 DNA疫苗進行了研究,指出了 FnBP和聚集因子 A(Clf A)是葡萄球菌性奶牛乳房炎發(fā)病機理中的重要蛋白。金黃色葡萄球菌 DNA疫苗是由 FnBP的 D121～34,D320～33和 Clf A的 aa 221 550基因片斷為模板擴增的菌體質粒 (pC I D 1D 3 I RESClf A)構成。另外疫苗中還含有誘導編碼顆粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因(pCI-bGM-CSF)的質粒,使機體的重組細胞 D 1D3和 Clf A蛋白含量增加,誘導機體淋巴細胞的生成,產(chǎn)生抵抗D 1D3和 Clf A的功能性抗體。臨床實踐證實,此 DNA疫苗對奶牛金黃色葡萄球菌有很好的保護性,安全性高[8]。

1.2 金黃色葡萄球菌苗的發(fā)展方向

葡萄球菌細胞壁上的抗原結構比較復雜,含有多糖和蛋白質兩類抗原。金黃色葡萄球菌的多糖為抗A型,化學組成為磷壁酸中的核糖醇殘基。由于多糖抗原有其特異性,所以常用多糖抗原制備疫苗。金黃色葡萄球菌莢膜多糖具有抗吞噬性,是金黃色葡萄球菌的致病因子之一。金黃色葡萄球菌莢膜多糖有特殊的血清型,莢膜產(chǎn)生的抗體有利于白細胞介導的調理素細胞吞噬的殺傷作用,殺傷金黃色葡萄球菌,提高機體對金黃色葡萄球菌癥的免疫能力?，F(xiàn)階段的疫苗研究主要集中于金黃色葡萄球菌莢膜多糖1,2,5,8和336等5種血清型抗原上。其中前 4種抗原的生物學特性已被證實,336的血清型抗原的化學結構和生物學特性還不清楚。這 5種血清型抗原的噬菌體是非特異性的,以往幾十年的研究中,在臨床和免疫學上都沒有找到特異性的噬菌體。試驗發(fā)現(xiàn),血清型 336的抗原不僅出現(xiàn)在無莢膜葡萄球菌上,而且也出現(xiàn)在血清型 5和血清型 8的菌株中[9]。今后的疫苗研究要著重篩選含有共同抗原的菌株來制備疫苗,增加疫苗的保護范圍[6]。

2 大腸桿菌苗

埃希氏大腸桿菌是引起奶牛急性和亞急性乳房炎的主要環(huán)境病原菌,其細胞壁脂多糖(LPS)由內向外分別為菌體Ag層、寡糖層和脂質A層。一些粗糙型細菌核心Ag暴露在外,故能制作菌苗,刺激機體產(chǎn)生抗體,能殺滅許多革蘭氏陰性菌;由于核心Ag屬于碳水化合物,故免疫期較短。大腸桿菌的主要抗原有 O,K,H等 3種,它們是大腸桿菌血清型鑒定的物質基礎。尿道致病性大腸桿菌 (Uropathogenic E.coli UPEC)是常見的牛乳房炎致病菌,它最常見的 O抗原群為O 2,O 8,O 21,O 81和 O 86,毒力因子為 Curli菌毛[10]。

2.1 現(xiàn)有的大腸桿菌疫苗

大腸桿菌疫苗目前研究和使用最多的是E.coli.J-5菌苗。該菌苗是一種缺乏尿苷二磷酸半乳糖異構酶的大腸桿菌突變體,不能將外源性半乳糖轉移到革蘭氏陰性菌細胞壁內的葡萄糖上,影響脂多糖的合成,從而造成各種寡糖的缺乏。另外 E.coli.J-5擁有不完全O-多糖,其特征是脂多糖的核心區(qū)和脂質A區(qū)抗原是裸露的。裸露的核心抗原刺激抗G-菌核心抗原的 Ig的產(chǎn)生,能保護多種腸桿菌的感染[11]。

Smith等用大腸桿菌J-5制成疫苗。E.coli.J-5菌苗由 5mL滅活菌體(109/m L)與 5m L弗氏不完全佐劑混合而成,通常采用皮下 3次免疫接種(泌乳末期第 14天,干奶期第 7天,干奶期第 30天)[12]。E.coli.J-5菌苗免疫可提高血清和牛奶中抗 E.coli.J-5核心抗原的抗體效價。Hogan等[13]認為,在干奶期間 E.coli J-5菌苗具有保護力是由于血清和牛奶中的抗 G-菌體抗原的 IgG和 IgM效價的升高,從而減輕了細菌感染的臨床癥狀。并能交叉抵抗其他血清型的E.coli.J的感染,產(chǎn)生其他腸桿菌抗原的抗體。Smith等[12]試驗證明,奶牛乳腺內免疫后牛奶中 IgG和 IgM效價比皮下免疫更高,在泌乳 21 d時乳腺內免疫奶牛的血清 IgM效價高于皮下免疫。雖然乳腺內免疫不會使腸桿菌性乳房炎臨床癥狀減輕,但E.coli.J-5菌苗在 2次皮下注射之間進行乳腺內免疫比 3次皮下注射免疫產(chǎn)生更高效價的 IgG和 IgM。Reinhard t等用 1,25-雙羥基 D 3作為佐劑,代替E.coli.J-5菌苗中的弗氏不完全佐劑,發(fā)現(xiàn)血清中 IgM,IgG和 IgA效價明顯提高,并能有效防止使用弗氏不完全佐劑造成注射部位出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象[14]。Enviracor J-5乳房炎疫苗由法瑪西亞公司生產(chǎn),1993年在美國使用[15]?，F(xiàn)在在美國,防治大腸桿菌型乳房炎疫苗已經(jīng)商品化生產(chǎn),市場上有 3種商品化大腸桿菌乳房炎疫苗,它們的商標分別為:J-5Bacterin(J5苗),Mastiguard.TM和Endovac-Bovi。所有大腸桿菌乳房炎疫苗生產(chǎn)中都采用革蘭氏陰性菌 (大腸桿菌)共同核心抗原制造可以防止多種革蘭氏陰性菌的感染。大腸桿菌在乳腺內的增殖與乳腺內游離的三價鐵離子的關系密切,大腸桿菌的生長和增殖離不開三價鐵離子,最近研究的 E.coli.J5疫苗結合了檸檬酸三鐵感受因子 A(FecA),增加了疫苗的效果。試驗證明,免疫后能夠刺激奶牛機體免疫球蛋白 G(IgG)的分泌,提高了大腸桿菌性乳房炎的自愈率[16]。

3 鏈球菌疫苗

引起奶牛乳房炎的鏈球菌主要是無乳鏈球菌(S.aga lactiae)、停乳鏈球菌 (S.dysalactiae)和乳房鏈球菌 (S.uberis),3種菌的形態(tài)相似,直徑為 0.5～1.0μm。3種菌感染的奶牛乳房炎,均不產(chǎn)生明顯的免疫,所以目前也無可靠的多價菌

苗[10]。

3.1 現(xiàn)有的鏈球菌疫苗

關于鏈球菌的疫苗研究的較少,主要是無乳鏈球菌和乳房鏈球菌,但效果都不理想。使用甲醛滅活后的無乳鏈球菌對奶牛無保護力;將甲醛滅活的乳房鏈球菌直接注入干奶期奶牛的乳房內,結果表明,在產(chǎn)犢后 2個月牛奶中仍可檢測到 IgGI和 IgA抗體。Poutrel等指出蛋白 X(一種絕大多數(shù)奶牛鏈球菌乳房炎菌株擁有的蛋白)與 B族鏈球菌莢膜多糖耦聯(lián)組成的疫苗能誘導產(chǎn)生調理性抗體。FinchM J等利用乳房鏈球菌 0140J活疫苗分別由皮下和乳房灌注的方法對健康奶牛進行免疫,然后分別用乳房鏈球菌 0140J和 C 221攻毒,結果表明,乳房鏈球菌活疫苗對同源的病原菌引起的乳房炎有一定的保護力,但是對異源的病原菌保護力較差,特異性強,而且指出皮下注射配合乳房內灌注的方法能增強疫苗的保護力。

在 Finch等的試驗中,用乳房鏈球菌的滅活苗反復免疫奶牛,可降低牛奶中的細菌數(shù)。但不能降低牛奶中的體細胞數(shù)。Giraudo等的一個田間試驗中采用了乳房鏈球菌和停乳鏈球菌多聯(lián)滅活苗,接種疫苗并不能顯著降低奶牛由鏈球菌引起的乳房炎的發(fā)生。到目前為止還無有效預防鏈球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。

3.2 鏈球菌苗的研究方向

無乳鏈球菌是一類導致奶牛乳房炎的重要病原菌,可以引起奶牛乳腺嚴重的炎癥反應,Michael等用血纖維蛋白溶酶受體蛋白 (GapC)的基因編碼乳房鏈球菌和無乳鏈球菌細胞表面相關的 GapC蛋白,但試驗證明,GapC的基因工程疫苗免疫后只對乳房鏈球菌乳房炎有保護性,而對無乳鏈球菌乳房炎無保護性,說明 GapC基因工程疫苗缺乏種間交叉保護性[17]。GapC和 αM IgG IgA復合物蛋白 (Mig),是由無乳鏈球菌 SDG 8菌株分泌的 2種蛋白,GapC與血纖維蛋白溶酶復合物蛋白(Plr)有 99.4%相同序列,Mig是位于SDG 8表面的一種蛋白。應用 GapC和Mig重組苗免疫奶牛后,檢測乳汁中體細胞的含量,兩者都能使乳汁中體細胞的含量降低,但是 GapC苗能使SDG8含量明顯降低,而 Mig苗卻沒有降低。此方面的機理還不很明確,有很大的研究空間[18]。

當前,研究微生物和宿主相互作用的技術,已發(fā)展到以基因組為基礎的 cDNA微點陣和蛋白質組技術水平。蛋白質組技術由于其無轉錄后和翻譯水平的修飾問題而比 cDNA微點陣技術更實用于對完全基因組進行假定疫苗候選物篩檢。蛋白質組技術包括雙相 (2D)凝膠電泳技術對蛋白進行分離和顯影,以及通過質譜分析 (MS)或 N端氨基酸測序法對蛋白斑點進行鑒定。在 2D凝膠中通過第 1相,使蛋白變性并根據(jù)其電荷量分離,隨后用 SDS處理使所有蛋白帶負電荷,這樣就可以在第 2相中根據(jù)蛋白質量大小進行分離。通過 MS或 N端氨基酸測序法對蛋白斑點進行鑒定,并與已知病原體的基因組序列進行同源性分析。對每一組分的免疫原性檢測,可用感染過疾病的宿主血清作探針,對蛋白斑點進行 Western blot分析。然而,這些蛋白的生物學意義和生理功能還需通過進一步分析加以驗證[10]。近年來,已通過采用這種方法對一些細菌病原體進行了分析。在對化膿性鏈球菌的研究中,從培養(yǎng)上清中得到了 66個蛋白斑點,從中確認了 53條特異序列和 44種不同的蛋白質。這些蛋白中的大部分對已感染患者的血清均呈現(xiàn)免疫原性,該工作對化膿性鏈球菌和宿主相互作用在分子水平上提供了新信息。

4 奶牛乳房炎多聯(lián)苗

國內研究的奶牛乳房炎疫苗多是乳房炎多聯(lián)苗。羅金印等在“七五”、“八五”期間,對我國進行了奶牛乳房炎主要病原菌區(qū)系調查及其抗原性研究,并初步研制了奶牛乳房炎多聯(lián)苗 A,B,C三種,羅金印等[19]從蘭州、青島、天津、重慶、西安、銀川和西寧等地的病牛乳中分離出的病原菌,經(jīng)培養(yǎng)、生化鑒定,選出生化反應典型、毒力強的菌株,通過免疫原性檢測菌種為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌的多聯(lián)苗 (A)。經(jīng)試驗,選健康泌乳牛 1 652頭,其中注苗組760頭,對照組 892頭。注射組比對照組乳房炎發(fā)病率降低 44.195%,具有很好的保護效果和明顯的臨床免疫效果。我國蘭州獸醫(yī)研究所研制的奶牛乳房炎多聯(lián)苗(金黃葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌),疫苗經(jīng)后海穴注射比肌注免疫效果提高 23%,注苗后無乳鏈球菌抗體含量最高,其次為金黃葡萄球菌和停乳鏈球菌,對鏈球菌引起的乳房炎有一定的免疫作用[20]。國外也有疫苗配合使用的報道,Sheik等運用 E.coli.J-5疫苗配合改良的都柏林沙門菌活疫苗來免疫新生乳牛,對乳房炎起到了很好的保護作用[21]。

5 展 望

奶牛乳房炎是由多種非特定的病原微生物引起的乳腺組織炎癥。至今尚未有徹底解決的辦法。在整體上控制奶牛乳房炎的發(fā)生,預防是重中之重。綜合國內外研究成果及結合國內奶牛養(yǎng)殖業(yè)的具體問題,奶牛乳房炎的預防主要是疫苗接種,搞好環(huán)境和牛體衛(wèi)生,采取適當?shù)臄D奶衛(wèi)生措施,定期檢查,干奶期治療所有的乳區(qū),加強飼養(yǎng)管理,增強奶牛體質,減少外傷因素,防止其他疾病的繼發(fā)等[22]。奶牛乳房炎疫苗的研制和開發(fā)對奶牛乳房炎的防治有著廣闊的前景。

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(責任編輯:石瑞珍)