竇珍珍(綜述)，劉 鋼(審校)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院感染科，北京 100045)

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)能夠引起肺炎、胸膜炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)2005年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全世界每年至少有160萬人死于侵襲性肺炎鏈球菌感染，其中70萬～100萬是<5歲的兒童，且發(fā)病人群主要集中在發(fā)展中國家[1]。我國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，肺炎鏈球菌是兒童肺炎最常見的病原體，也是細(xì)菌性腦膜炎主要的病原體之一，1970～2005年肺炎鏈球菌引起的細(xì)菌性腦膜炎在占全部確診病例的10%～30%[2]。

目前，接種肺炎鏈球菌疫苗是最有效的預(yù)防肺炎鏈球菌疾病的方法。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法由于試劑相對便宜、結(jié)果客觀、能直接檢測臨床標(biāo)本的可能性[3]而日益受到關(guān)注。不同的科研團(tuán)隊設(shè)計出了不同的檢測方法，以下對各種實驗方法予以綜述。

1 肺炎鏈球菌疫苗的重要意義

美國2000～2008年推廣使用肺炎鏈球菌7價蛋白多糖結(jié)合疫苗(7-valent polysaccharide-protein conjugate vaccine,PCV7)(PCV7覆蓋的血清型為4、6B、9V、14、18C、19F和23F)期間，人群中侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率在<5歲的兒童中下降了77%，因肺炎入院治療的<2歲兒童下降了39%[4]。歐洲有文獻(xiàn)報道稱，應(yīng)用PCV7的國家其侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率下降[5]?；赑CV7在降低侵襲性肺炎鏈球菌疾病發(fā)病率的顯著成績，WHO已經(jīng)推薦PCV7作為國家免疫計劃中的優(yōu)先項目[1]。肺炎鏈球菌疫苗中除了PCV7外，目前還有13價蛋白多糖結(jié)合疫苗、23價莢膜多糖疫苗。這些疫苗均為血清型特異性疫苗，它們對人群的保護(hù)作用與疫苗對當(dāng)?shù)刂虏⌒苑窝祖溓蚓逍偷母采w率有關(guān)。雖然目前PCV7在預(yù)防肺炎鏈球菌疾病方面已有效果，但肺炎鏈球菌血清型監(jiān)測仍然十分重要。對于已將PCV7納入國家免疫計劃項目的國家，PCV7對侵襲性肺炎鏈球菌血清型分布的長期影響尚不十分明確。有地區(qū)報道稱，應(yīng)用PCV7后導(dǎo)致了血清型替換現(xiàn)象，即非疫苗血清型定植、致病增多的現(xiàn)象[6-8]。如果肺炎鏈球菌疫苗對侵襲性肺炎鏈球菌血清型覆蓋率降低，對人群的保護(hù)效益可能降低。對未納入PCV7作為國家免疫計劃項目的國家(主要是發(fā)展中國家和地區(qū))，監(jiān)測肺炎鏈球菌的重要性主要體現(xiàn)以下三個方面：①目前肺炎鏈球菌感染死亡病例主要是在發(fā)展中國家；②這些國家和地區(qū)缺乏完善的肺炎鏈球菌血清型監(jiān)測信息；③目前應(yīng)用的PCV7覆蓋的血清型種類的設(shè)計主要是基于歐洲和北美發(fā)達(dá)國家侵襲性肺炎鏈球菌血清型的監(jiān)測，而已有文獻(xiàn)報道稱PCV7的覆蓋率具有顯著的地區(qū)差異[1]。

目前檢測肺炎鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)是莢膜腫脹實驗。莢膜特異性抗體和莢膜結(jié)合后在顯微鏡下可觀察到莢膜腫脹顯著，莢膜腫脹實驗就是利用這種原理用血清型已知的抗體檢測菌株的血清型。這種方法的缺點主要是試劑昂貴、結(jié)果判讀主觀，且檢測過程需要培養(yǎng)細(xì)菌。血清型檢測試劑的昂貴限制了經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)地區(qū)肺炎鏈球菌血清型的檢測，主觀的判讀使部分菌株的結(jié)果有誤，且檢測結(jié)果還依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，而使得血清型檢測結(jié)果也受培養(yǎng)陽性率的限制。

2 肺炎鏈球菌莢膜基因結(jié)構(gòu)

肺炎鏈球菌莢膜的生成主要受莢膜基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)控制，除血清型3和37外，其余血清型的莢膜均由Wzy/Wzx依賴的途徑生成并由cpsA-D調(diào)節(jié)，這些基因均存在于dexB和aliA之間。cpsA-D是靠近dexB端的前4個相對保守的基因，cpsD和aliA之間的基因是血清型特異性的基因區(qū)域[9](圖1)。血清型37的肺炎鏈球菌通過cps外的tts基因指導(dǎo)，由合酶途徑合成莢膜[10]。但在dexB和aliA之間，血清型37有與33F非常相似的結(jié)構(gòu)，只是在cap37B，cap37E，cap37N和cap37O存在沉默子，這些沉默子導(dǎo)致該區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)不能編碼莢膜(圖2)[10]。血清型3亦依賴合酶途徑合成莢膜[11]。血清型3無cpsA-D基因，但是其orf1和dexB之間的一段序列和血清型19F的cpsA、cpsB相似，orf1、orf2分別與cpsC、cpsD相似，orf2下游和cap3A之間是一段長度為1096 bp 19F缺失的序列(圖3)[12]。cap3A、cap3B、cap3C是血清型3特異性序列[13]。雖然cpsA-D在所有的血清型之間相對保守，但cpsA和cpsB仍存在與血清型相關(guān)的多態(tài)性[14-17]。莢膜基因是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法的基礎(chǔ)。目前，93種血清型的莢膜基因序列都已測出[9](http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/)，這將助于以分子生物學(xué)方法研究肺炎鏈球菌的血清型。

圖1 血清型cps結(jié)構(gòu)圖

圖2 血清型33F和血清型37 cps結(jié)構(gòu)圖

圖3 血清型3和血清型19Fcps結(jié)構(gòu)圖

3 已有的分子生物學(xué)檢測方法

已有的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法可分為兩類，一類是以檢測cps基因血清型特異性區(qū)域為基礎(chǔ)的方法，如多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR反向線性雜交、基因芯片；另一類是以檢測與血清型相關(guān)的cps基因多態(tài)性為基礎(chǔ)的方法，如限制性片段多態(tài)性、以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法。

3.1多重PCR和連續(xù)多重PCR 多重PCR檢測血清型是利用多種血清型特異性引物的混合物與待測標(biāo)本提取的DNA進(jìn)行PCR擴增，通過PCR擴增產(chǎn)物的大小判斷待測標(biāo)本的血清型。2005年，O′Halloran等[18]設(shè)計了用1個反應(yīng)體系檢測PCV7覆蓋的7種肺炎鏈球菌血清型，結(jié)果顯示這種方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測所覆蓋的7種血清型的所有菌株。但是，PCV7推廣應(yīng)用后出現(xiàn)的血清型替換現(xiàn)象可使PCV7覆蓋率下降的同時，也削弱該方法檢測肺炎鏈球菌血清型的能力[6-8]。

增加血清型檢測范圍可削弱血清型替換對血清型檢測方法的影響，但是多重PCR體系需要考慮引物的兼容性以及擴增產(chǎn)物的大小[19-20]，因此在一個PCR反應(yīng)體系中能夠檢測的血清型的種類是有限的。連續(xù)多重PCR通過多次多重PCR(每次多重PCR引物組成不同)增加了血清型檢測范圍。2006年，Pai等[19]設(shè)計的連續(xù)多重PCR能夠檢測28種常見致病性肺炎鏈球菌。此方法共包含有7步PCR反應(yīng)，每一步PCR反應(yīng)能夠檢測4種血清型，每一步PCR均擴增cpsA基因作為內(nèi)對照，常見的致病血清型用第一步PCR和第二步PCR檢測，以便使用最少的PCR反應(yīng)步驟檢測血清型的分布。檢測過程中，血清型特異性PCR產(chǎn)物對應(yīng)的血清型為標(biāo)本的血清型，PCR反應(yīng)后若cpsA陽性但血清型特異性PCR陰性則進(jìn)入下一步PCR，7步PCR完成后若仍只有cpsA陽性，則該標(biāo)本的血清型未包括在連續(xù)多重PCR檢測范圍內(nèi)，cpsA陰性的標(biāo)本為未分型菌株[19]。

連續(xù)多重PCR的檢測效率高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，且檢測成本遠(yuǎn)低于莢膜腫脹實驗。用連續(xù)多重PCR的方法檢測了隨機從2002～2003年收集的菌株中挑選的421株菌株，前3步多重PCR能檢測62.5%菌株的血清型，7步PCR完成后401(95.2%)株菌株能確定血清型/群，20株菌株不能確定血清型/群的菌株為未分型菌株或檢測范圍外的血清型[19]。應(yīng)用連續(xù)多重PCR預(yù)測的血清型結(jié)果與莢膜腫脹實驗預(yù)測結(jié)果均相符[19]。Pai等[19]統(tǒng)計，莢膜腫脹實驗檢測肺炎鏈球血清型的平均成本是28美元，而應(yīng)用連續(xù)多重PCR，3步PCR完成血清型檢測的成本是2.28美元，7步PCR完成血清型檢測的成本是5.32美元。此外，還可根據(jù)當(dāng)?shù)胤窝祖溓蚓逍土餍星闆r調(diào)整血清型的檢測步驟、增加血清型的檢測范圍。在血清型分布不同的地區(qū)連續(xù)多重PCR的應(yīng)用有很強的靈活性，已有巴西[21]、西班牙[22]、比利時[23]、孟加拉國[24]、芬蘭[25]、韓國[26]、中國[27]、撒哈拉以南的非洲地區(qū)[28]的研究人員根據(jù)當(dāng)?shù)胤窝祖溓蚓逍土餍胁W(xué)資料在原始連續(xù)多重PCR的基礎(chǔ)上設(shè)計并驗證了新的血清型檢測方案。以連續(xù)多重PCR為基礎(chǔ)的血清型檢測方法可直接檢測生物標(biāo)本中的肺炎鏈球菌血清型，孟加拉國的研究人員已經(jīng)利用這種方法檢測了培養(yǎng)陰性的腦脊液中肺炎鏈球菌的血清型[29]。連續(xù)多重PCR還可以檢測存在多種血清型標(biāo)本的血清型。檢測中耳炎患者鼻咽部分泌物中肺炎鏈球菌血清型的研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽部分泌物分離培養(yǎng)的菌株用莢膜腫脹實驗檢測結(jié)果為19F，而用連續(xù)多重PCR直接從鼻咽部分泌物提取的DNA，可同時檢測出血清型19F和23F[30]。

多重PCR產(chǎn)生錯誤結(jié)果的主要原因是讀膠時產(chǎn)生錯誤[20]，PCR擴增產(chǎn)物大小接近，同一個PCR反應(yīng)體系檢測的血清型種類過多則增加發(fā)生這種錯誤發(fā)生的概率，因此單個PCR反應(yīng)體系檢測的血清型不宜過多。

3.2多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術(shù) 多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術(shù)檢測肺炎鏈球菌血清型的技術(shù)基礎(chǔ)為特異性探針與目標(biāo)DNA雜交，它們共同的特點是在擴大血清型檢測范圍的同時最大限度地減少PCR反應(yīng)次數(shù)。

2006年，Kong等[31]利用多重PCR反向線性雜交技術(shù)，設(shè)計了能夠檢測23組共40種血清型的血清型檢測方法。2007年，Zhou等[32]又設(shè)計了20組共50種少見血清型的檢測方法(不包括6C、6D和11E)。多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測肺炎鏈球菌的血清型，首先對標(biāo)本提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴增(血清型特異性PCR)，然后利用尼龍膜上結(jié)合的血清型特異性的單核苷酸探針和生物素標(biāo)記的多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物雜交，再利用過氧化物酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素和生物素結(jié)合并利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)檢測過氧化物酶，最后利用探針位置及種類與尼龍膜對應(yīng)的膠片檢測熒光。膠片上產(chǎn)生熒光的位置對應(yīng)的探針種類就是被檢測標(biāo)本的血清型[31]。Kong等[31]用設(shè)計的多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測266株菌株，Zhou等[32]用設(shè)計的多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測了152株菌株，除血清型未覆蓋菌株和未分型菌株雜交結(jié)果陰性外，其余菌株的血清型預(yù)測結(jié)果和莢膜腫脹實驗一致或包含了莢膜腫脹實驗結(jié)果(血清型組包含2種或以上的血清型)。

基因芯片是不同血清型的DNA探針按照一定順序排列的微小基片。

2007年，Wang等[33]設(shè)計了通過檢測肺炎鏈球菌wzy基因和cap基因(血清型3)來檢測24組共43種血清型的基因芯片(多重PCR發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型歸為同一組)?；蛐酒?，每組血清型有兩種探針，同時有兩種16SrDNA探針作為陽性對照，40個T組成的探針作為陰性對照。用這種基因芯片檢測血清型過程如下：DNA樣本經(jīng)一次多重PCR擴增后，以擴增產(chǎn)物為模板，將雙向引物換成單向引物并加入Cy3-dUTP后，在相同的實驗條件下再次擴增，再次擴增的產(chǎn)物與芯片雜交，基因芯片平掃儀檢測雜交后芯片的信號，所收集的數(shù)據(jù)通過相關(guān)軟件分析后可確定血清型種類。

Wang等[33]用設(shè)計的基因芯片檢測了169株標(biāo)本(147株屬于檢測范圍的43種血清型，11株為檢測范圍外的血清型，11株為其他病原體)，結(jié)果與莢膜腫脹實驗的結(jié)果相符。此外，這種基因芯片檢測血清型的靈敏度較高。研究發(fā)現(xiàn)，DNA提取濃度為1010 cfu/L時，用基因芯片能確定血清型種類，而用多重PCR則無法檢測血清型[32]。因此，在檢測DNA含量較少的臨床標(biāo)本時，基因芯片檢測血清型有顯著的優(yōu)勢。

2011年Tomita等[34]設(shè)計了一種新的檢測血清型的基因芯片。芯片通過與肺炎鏈球菌GT基因(糖基轉(zhuǎn)移酶基因)雜交而能檢測23組共37種血清型(多重PCR發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型歸為同一組)?；蛐酒?，每組血清型檢測1～6個GT基因，每一個GT基因有3種不同的探針。此外，基因芯片上包含了16SrDNA以及與肺炎鏈球菌的7個看家基因(aroE/ddl/gdhA/glcK/spi/tktA/xpt)互補的探針作為陽性對照，與肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌的看家基因互補的探針作為陰性對照。血清型檢測過程中，基因芯片直接與提取的菌株基因組DNA雜交，分析數(shù)據(jù)判斷血清型。該方法僅檢測了檢測范圍內(nèi)的36種血清型的36株肺炎鏈球菌，其中1株結(jié)果和莢膜腫脹實驗結(jié)果不符。目前，基因芯片血清型檢測的準(zhǔn)確性還需要更進(jìn)一步的提高。

與連續(xù)多重PCR相比，多重PCR反向線性雜交及基因芯片技術(shù)最大的特點是檢測的血清型種類多，且不需要多次進(jìn)行PCR反應(yīng)，但是這種方法涉及的引物及探針種類多(多重PCR反向線性雜交檢測90種血清型需200種引物或探針)，多種血清型之間可發(fā)生交叉反應(yīng)(多重PCR反應(yīng)線性雜交檢測的90種血清型中有58種血清型能發(fā)生交叉反應(yīng))，能發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型需與其他血清型檢測方法結(jié)合方能進(jìn)一步區(qū)分。目前發(fā)現(xiàn)的肺炎鏈球菌血清型種類雖已達(dá)93種，但常見的血清型種類有限，連續(xù)多重PCR前三步PCR反應(yīng)就能夠檢測60%～90%的肺炎鏈球菌菌株的血清型[19,21-23,25-26,28-30]。因此在檢測常見血清型時，上述兩種血清型檢測方法在時間消耗、操作以及血清型檢測成本上并無明顯優(yōu)勢。利用基因芯片檢測血清型的缺點是該方法的設(shè)備有特殊要求(需要基因芯片掃描儀)，對于經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)地區(qū)的應(yīng)用可能受到限制。

3.3限制性片段長度多態(tài)性 限制性片段長度多態(tài)性是一種可用于檢測基因多態(tài)性的分子生物學(xué)分析方法，同源DNA，因為存在基因多態(tài)性，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶后可產(chǎn)生不同的DNA片段圖譜。Lawrence等[16]發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌cpsA和cpsB基因限制性片段長度多態(tài)性與血清型相關(guān)，根據(jù)這一特點，設(shè)計了通過檢測限制性片段長度的多態(tài)性而預(yù)測肺炎鏈球菌11種血清型的檢測方法。每種血清型的cpsA-cpsB PCR擴增產(chǎn)物分別用AluI、HinfI和RsaI3種酶進(jìn)行酶切，同種酶得到的條帶分型用譜圖分析軟件(GelCompar,version 4.1)進(jìn)行對比分析并命名，每一種血清型可獲得3種酶切后的條帶分型。通過研究11種血清型條帶分型，建立條帶分型和血清型關(guān)系數(shù)據(jù)庫。血清型未知的菌株的條帶分型和數(shù)據(jù)庫中條帶分型的相似度≥90%時，認(rèn)為是相同的條帶分型，可以通過對比血清型已知的條帶分型數(shù)據(jù)庫預(yù)測未知肺炎鏈球菌的血清型。

Lawrence等[16]用建立的數(shù)據(jù)庫檢測了93株菌株，87株檢測結(jié)果與莢膜腫脹實驗相符，1株血清型為1的菌株被預(yù)測為血清型1或19F，4株血清型為6A的菌株被預(yù)測為6B，2株血清型分別為6B和9V的菌株出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫中，未有條帶分型被錯誤判斷為非疫苗菌株。提示某些菌株只能給出血清型可能范圍，這種方法不能正確區(qū)分血清型6A和6B，新的條帶分型可導(dǎo)致血清型判斷錯誤。

Batt等[35]擴增dexB和ailA之間的所有序列(大小為14～23 kpb)，并單獨應(yīng)用Hinfl酶切獲得條帶分型。通過46種血清型已知的菌株建立了46種血清型條帶分型的數(shù)據(jù)庫。用該數(shù)據(jù)庫檢測了73株菌株，所有菌株的結(jié)果均和莢膜腫脹實驗相符。與Lawrence等[16]設(shè)計的方法相比，Batt等[35]設(shè)計的方法在構(gòu)建條帶、分型數(shù)據(jù)庫以及條帶對比時更簡單。Lawrence設(shè)計的方法，每種血清型對應(yīng)3種條帶分型。Batt等設(shè)計的方法是每種血清型對應(yīng)1種條帶分型。但是，Batt設(shè)計的方法PCR擴增產(chǎn)物高達(dá)14～23 kpb，這在擴增產(chǎn)物方面增加了難度。

限制性長度片段多態(tài)性的缺點是每次進(jìn)行檢測都必須有標(biāo)準(zhǔn)株建立比對的數(shù)據(jù)庫，而且，血清型檢測范圍內(nèi)的菌株如出現(xiàn)新的條帶分型，會導(dǎo)致結(jié)果判讀錯誤。

3.4測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法 肺炎鏈球菌cpsA 3′端到cpsB 5′端之間的序列多態(tài)性與血清型相關(guān)[15-16]。Kong等[17,36]通過對90種血清型的這段基因進(jìn)行測序，建立了部分cpsA-cpsB血清型預(yù)測系統(tǒng)。血清型未知的菌株在cpsA 3′端和cpsB 5′端之間的序列和部分cpsA-cpsB血清型預(yù)測系統(tǒng)比對可預(yù)測血清型未知菌株的血清型。

2011年，Leung等[14]設(shè)計了一種新的以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法。他們擴增的區(qū)域位于cpsA下游1351位點到cpsC下游224位點之間，擴增產(chǎn)物達(dá)1064 kpb，但是兩側(cè)的測序結(jié)果可能不確切，因此采用中間的732 kpb與基因庫比對，比對后分?jǐn)?shù)最高的對應(yīng)的血清型為血清型檢測結(jié)果。這種新的以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法通過比對PPV23覆蓋的血清型的基因序列設(shè)計引物，除 PPV23覆蓋的血清型外，還可以擴增另外61種血清型。Leung等用該方法檢測了138株菌株，僅1株菌株血清型預(yù)測錯誤。

以這兩種測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法的引物結(jié)合區(qū)都是相對保守區(qū)域，能與引物結(jié)合的血清型種類多，這使血清型檢測過程中涉及的引物種類少(Kong等[17,36]設(shè)計的檢測方法需要三對引物；Leung等[14]設(shè)計的檢測方法需要一對引物)。這一特點簡化了血清型檢測過程。但是，由于引物不是血清型特異性引物，混雜其他血清型的DNA對血清型檢測的影響還需要進(jìn)行進(jìn)一步試驗來判斷。

4 小 結(jié)

與莢膜腫脹實驗相比，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法雖然有試劑相對便宜、結(jié)果客觀以及有直接檢測培養(yǎng)陰性臨床標(biāo)本的可能性的優(yōu)點，但也有不足。首先，目前設(shè)計的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法均不能完全區(qū)分所有的血清型。一些血清型相近的菌株莢膜基因差異很小而在PCR過程中會發(fā)生交叉反應(yīng)，如血清型6A和6B在wciP基因上存在單個核苷酸多態(tài)性[37]。一些血清型雖并不相似，但可能因為PCR擴增的目的基因相似而發(fā)生交叉反應(yīng)，如35F和47F，33F、33A和37[19,31]。其次，肺炎鏈球菌的血清型屬于莢膜抗原特異性，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法只是一種間接的血清型檢測方法，它的檢測結(jié)果可以與莢膜腫脹實驗的結(jié)果不一致。有文獻(xiàn)報道稱，用莢膜腫脹實驗檢測血清型為19F的2株基因背景不一樣的菌株血清型特異性PCR擴增產(chǎn)物為19A，將該菌株wzy基因測序比對后發(fā)現(xiàn)，這2株菌株wzy基因與血清型19Fwzy基因的相似度為92%，而與血清型19Awzy基因的相似程度為80%[25]。因此，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法不能完全替代莢膜腫脹實驗。盡管如此，其還是可以與莢膜腫脹實驗聯(lián)合應(yīng)用以降低血清型檢測成本。目前，連續(xù)多重PCR經(jīng)驗證是使用最多的血清型檢測方法，僅極少量菌株的檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤，極少量的菌株因引物區(qū)的基因多態(tài)性而PCR擴增失敗[23]。芬蘭已將連續(xù)多重PCR作為血清型檢測的常規(guī)方法，用連續(xù)多重PCR不能檢測出血清型的菌株或因交叉反應(yīng)血清型不能確定的菌株再用莢膜腫脹實驗確定血清型。聯(lián)合應(yīng)用連續(xù)多重PCR和莢膜腫脹實驗，降低了血清型檢測成本[25]。

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