劉麗霞(綜述)，殷 宏(審校)

(中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

自Price等[1]從雙殼類軟體動物(Macrocallista nimbosa)中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離出一種興奮心臟的多肽分子，苯丙氨酸-蛋氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-NH2(Phe-Met-Arg-Phe-NH2，F(xiàn)MRFamide)，大量C末端為精氨酸-苯丙氨酸-NH2(RFamide)的生物活性肽從多物種中被分離并鑒定。由于這些多肽的C末端都具有相同的結構：RFamide，故將其統(tǒng)稱為RF酰胺肽。大約10年前，這個多肽家族又先后發(fā)現(xiàn)了兩條新的神經(jīng)肽，親吻肽(kisspeptin)和促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)[2-4]。近年越來越多的證據(jù)證實，它們能夠直接作用于促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元，并對生殖軸的反饋調控起重要作用[5]。

由于GnRH神經(jīng)元不具備性類固醇激素受體，生殖軸反饋調節(jié)研究中的一個重要課題就是性激素通過什么途徑來調節(jié)GnRH的分泌。近年的研究發(fā)現(xiàn)，親吻肽、GnIH及其受體與正常繁殖有密切的關系；親吻肽與GnIH都是RF酰胺肽家族的成員，它們所在神經(jīng)元接收來自性類固醇激素的信號，分泌的相關RF酰胺肽直接作用于GnRH細胞，對生殖軸互為拮抗進行調控[5]。本綜述將從發(fā)現(xiàn)到表達分布及功能比較闡述親吻肽和GnIH這對神經(jīng)肽，探討兩者對生殖軸的拮抗性調節(jié)作用。

1 親吻肽與GnIH的發(fā)現(xiàn)

2001年，現(xiàn)在被稱為親吻肽的RF酰胺肽,被證明是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)的內源性配體[2-3]。由于編碼親吻肽的基因Kiss 1最初被認為是一種抑制腫瘤轉移的因子，該基因的產物起初也被稱為腫瘤遷移抑制因子。2003年，親吻肽調節(jié)生殖功能的作用首次被發(fā)現(xiàn)。人們在性腺功能低下的個體GPR54基因中發(fā)現(xiàn)有一個突變，并且在缺乏GPR54的人和小鼠的下丘腦不能促使垂體分泌足夠的促性腺激素，而垂體對外源性GnRH的反應卻不受影響[6]?；谶@些初步的了解，一些實驗室開始系統(tǒng)研究親吻肽調節(jié)GnRH的神經(jīng)通路及其細胞和分子的機制。

GnIH的發(fā)現(xiàn)則是應用抗C末端RF-NH2序列的抗體，通過高效液相色譜及競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗，從鵪鶉腦中被分離鑒定出來[4]。其為一條C末端為RFamide的十二肽：絲氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-脯氨酸-絲氨酸-丙氨酸-絡氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-NH2(SIKPSAYLPLRFamide)。這個新型的下丘腦RF酰胺肽迅速地、劑量相關地抑制鵪鶉垂體原代培養(yǎng)細胞釋放促黃體激素。GnIH的受體(G protein-coupled receptor 147,GPR147)，一條新型的G蛋白偶聯(lián)受體，也已在日本鵪鶉腦內被克隆和鑒定[7]。之后，在多種生物(魚類、兩棲類、哺乳類動物，乃至人類)的腦內都發(fā)現(xiàn)了GnIH及其受體的同源類似物[8]。在鳥類，GnIH前體基因編碼三條活性肽：GnIH、GnIH相關肽1(GnIH related peptide 1,GnIH-RP1)和GnIH相關肽2(GnIH related peptide 2,GnIH-RP2)；而在哺乳類，其編碼兩條活性肽：GnIH-1和GnIH-3。遺傳上的保守性提示該基因在進化中起重要作用。

2 親吻肽與GnIH在腦內的分布

在哺乳動物的腦中具有兩種親吻肽細胞的主要類型，一種存在于弓形核，另一種存在于視前區(qū)。在嚙齒類動物中，后一種細胞存在于前腹室旁核(anteroventral periventricular nucleus,AVPV)及視交叉前室旁核(preoptic periventricular nucleus,PeV)中。在AVPV/PeV的親吻肽神經(jīng)元表達雌激素受體(estrogen receptor-α,ERα)，并且雌激素上調親吻肽的表達。另外，雌激素還下調弓形核的親吻肽神經(jīng)元表達[9]。

GnIH神經(jīng)元在鳥類被發(fā)現(xiàn)僅存在于下丘腦室旁核，而纖維則廣泛地向腦內頭側投射到腹原紋狀體、外側和內側隔、視前區(qū)，向尾側投射到正中隆起、頂蓋和腦干[10]。在嚙齒類和靈長類動物腦內，GnIH末梢也在視前區(qū)、隔和布羅卡斜角帶(diagonal band of Broca)有發(fā)現(xiàn)，而這些區(qū)域均有GnRH神經(jīng)元存在。在羊腦內，具有GnIH免疫活性的擴張纖維存在于接近GnRH細胞的區(qū)域。和鳥類一樣，在靈長類、羊、倉鼠、大小鼠腦中，40%～80%的GnRH細胞緊密接觸有GnIH的免疫活性纖維，說明GnIH可通過直接或間接方式調控GnRH細胞[11]。

3 親吻肽對生殖軸的正反饋調節(jié)作用

3.1親吻肽細胞直接傳遞性類固醇反饋調控信號給GnRH細胞 關于雌激素的反饋，由原位雜交及免疫組織化學試驗可知，在雌性小鼠腦的AVPV中60%以上的親吻肽細胞表達ERα[12]。由免疫組織化學染色反應得知，在雌性大鼠腦的AVPV/PeV中，大約90%的親吻肽細胞表達ERα。在羊腦的弓形核中，基本上所有親吻肽細胞都表達ERα，而在外側視前區(qū)中有50%細胞表達ERα(圖1-3，見封三)。

圖1 親吻肽神經(jīng)元參與雌激素對GnRH的正反饋調節(jié) 1-1：AVPV親吻肽神經(jīng)元表達ER(ERα:箭頭所指；Kiss-1 mRNA陽性細胞：三角所指。免疫染色加原位雜交，標尺：25μm)[15]；1-2：親吻肽神經(jīng)元末端投射到GnRH神經(jīng)元(親吻肽免疫反應陽性神經(jīng)末梢：黑色；GnRH免疫陽性細胞體：棕色；箭頭所指為接觸點。雙標記免疫組織化學染色，標尺：15 μm)[16]；1-3：GnRH神經(jīng)元表達GPR54的mRNA(GPR54 mRNA：銀染顆粒，白色點群；GnRH mRNA：Vector Red標記，紅色。雙標記原位雜交，標尺：20μm)[17]

圖2 GnIH神經(jīng)元參與雌激素對GnRH的負反饋調節(jié) 2-1：GnIH神經(jīng)元表達ER(雙標記免疫熒光染色，×1000)；2-2～2-4：GnIH神經(jīng)元直接投射于GnRH神經(jīng)元上(雙標記免疫組織化學染色，×1000)，其中2-2為GnRH神經(jīng)元，2-3為GnIH免疫陽性神經(jīng)纖維，2-4為2-2與2-3重合結果[19]

向腦室中注射親吻肽10后，對腦脊液中GnRH的測量發(fā)現(xiàn)，親吻肽的注射可引起GnRH的分泌。并且，所有這些GnRH細胞都表達親吻肽的同源受體GPR54，以上證據(jù)說明親吻肽可接收雌激素調控信號并直接作用于GnRH細胞[13]。

3.2親吻肽細胞對雌激素的正反饋調控作用 按照一系列判斷標準，包括Kiss1基因表達、免疫組織化學測定親吻肽水平及通過基因剔除和置換模型等方法進行的研究，可知AVPV/PeV中親吻肽細胞群在功能學上包含于雌激素的正反饋調節(jié)內，并且與嚙齒類動物排卵前高峰的產生具有重要的聯(lián)系[14]。在對小鼠及大鼠的研究中許多不同實驗室得出一致結論，即在排卵前期(動情前期)大鼠及小鼠腦內AVPV/PeV中親吻肽細胞上調，而在此時弓形核中親吻肽細胞下調。因此，認為AVPV/PeV中的親吻肽細胞對雌激素正反饋作用的傳導起重要作用，這種正反饋作用誘導這類動物體內GnRH/促黃體激素在排卵前的釋放。

4 GnIH對生殖軸的負反饋調節(jié)作用

在羊及非人靈長類中，GnIH神經(jīng)元表達雌激素受體，具有GnIH免疫活性的擴張纖維存在于接近GnRH細胞的區(qū)域(圖2-4，見封三)[18-19]。在這種解剖學的基礎上，功能學證據(jù)證明GnIH對GnRH可發(fā)揮直接作用：向腦室內注射GnIH-3可降低去卵巢倉鼠及性腺完整大鼠血液中促黃體激素的分泌，腦室內注射GnIH的反義寡核苷酸鏈可使大鼠血液中促黃體激素的水平升高到發(fā)情期前[19-20]。這些功能學數(shù)據(jù)與觀察到的GnIH細胞投射到GnRH細胞的結果一致，說明GnIH細胞能夠被性類固醇激活，參與介導性類固醇激素的負反饋調控。

向切除卵巢的大鼠靜脈注射GnIH 2 h之后，血液中促黃體激素的水平降低。向切除卵巢的羊體內連續(xù)注射GnIH-3可持續(xù)降低促黃體激素的脈沖性分泌，而對血液中其他垂體激素(如生長激素或催乳素)的水平卻沒有影響。在培養(yǎng)大鼠、羊及牛的垂體細胞中觀察到，給予GnIH對GnRH刺激的促黃體激素分泌具有劑量依賴性降低作用，這一結果支持了GnIH對垂體促性腺細胞具有直接作用這一觀點[21]。因此，GnIH可在下丘腦和垂體兩個水平上抑制促性腺激素的產生和分泌。

5 小 結

作為神經(jīng)生殖研究中重要的神經(jīng)內分泌調節(jié)因子，親吻肽與GnIH的發(fā)現(xiàn)，引發(fā)了人們對生殖軸反饋調控的知識結構性改變。這兩個RF酰胺肽在生殖軸的反饋調控方面相互拮抗，親吻肽主要表現(xiàn)為正反饋，GnIH則表現(xiàn)為負反饋調節(jié)作用。它們所在的神經(jīng)元接收來自性類固醇激素的信息，分泌的多肽直接或間接作用于GnRH神經(jīng)元，參與類固醇激素對生殖軸的反饋調控。

目前對于這兩種RF酰胺肽相互之間的調節(jié)作用還了解甚少，親吻肽能否作用于GnIH神經(jīng)元以及GnIH對親吻肽細胞的影響都尚屬未知。由于GnIH免疫陽性神經(jīng)纖維亦投射到弓形核，GnIH是否通過抑制在弓形核的親吻肽神經(jīng)元進而參與GnRH的分泌調節(jié)，是下一步應該闡明的問題之一。在研究這一組神經(jīng)肽的相互作用過程中，尚可建立親吻肽/GnIH雙剔除動物模型，以研究雙向缺失這兩種直接調控GnRH細胞的神經(jīng)肽，生殖系統(tǒng)可能出現(xiàn)的結果，進而評價兩者對生殖調控的重要性。

[1] Price DA,Greenberg MJ.Structure of a molluscan cardioexcitatory neuropeptide[J].Science,1977,197(4304):670-671.

[2] Ohtaki T,Shintani Y,Honda S,etal.Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor[J].Nature,2001,411(6837):613-617.

[3] Kotani M,Detheux M,Vandenbogaerde A,etal.The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes kisspeptins,the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54[J].J Biol Chem,2001,276(37):34631-34636.

[4] Tsutsui K,Saigoh E,Ukena K,etal.A novel avian hypothalamic peptide inhibiting gonadotropin release[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,275(2):661-667.

[5] Clarke IJ.Control of GnRH secretion:one step back[J].Frontiers in Neuroendocrinology,2011,32(3):367-375.

[6] Seminara SB,Messager S,Chatzidaki EE,etal.The GPR54 gene as a regulator of puberty[J].N Engl J Med,2003,349(17):1614-1627.

[7] Yin H,Ukena K,Ubuka T,etal.A novel G protein-coupled receptor for gonadotropin-inhibitory hormone in the Japanese quail (Coturnix japonica):identification,expression and binding activity[J].J Endocrinol,2005,184(1):257-266.

[8] Smith JT,Clarke IJ.Gonadotropin inhibitory hormone function in mammals[J].Trends Endocrinol Metab,2010,21(4):255-260.

[9] Tomikawa J,Uenoyama Y,Ozawa M,etal.Epigenetic regulation of Kiss1 gene expression mediating estrogen-positive feedback action in the mouse brain[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109 (20):E1294-E1301.

[10] Ukena K,Ubuka T,Tsutsui K.Distribution of a novel avian gonadotropin-inhibitory hormone in the quail brain[J].Cell Tissue Res,2003,312(1):73-79.

[11] Clarke IJ,Qi Y,Puspita Sari I,etal.Evidence that RF-amide related peptides are inhibitors of reproduction in mammals[J].Front Neuroendocrinol,2009,30(3):371-378.

[12] Gottsch ML,Cunningham MJ,Smith JT,etal.A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse[J].Endocrinology,2004,145(9):4073-4077.

[13] Messager S,Chatzidaki EE,Ma D,etal.Kisspeptin directly stimulates gonadotropin-releasing hormone release via G protein-coupled receptor 54[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(5):1761-1766.

[14] Wintermantel TM,Campbell RE,Porteous R,etal.Denition of estrogen receptor pathway critical for estrogen positive feedback to gonadotropin-releasing hormone neurons and fertility[J].Neuron,2006,52(2):271-280.

[15] Adachi S,Yamada S,Takatsu Y,etal.Involvement of anteroventral periventricular Metastin/Kisspeptin neurons in estrogen positive feedback action on luteinizing hormone release in female rats[J].J Reprod Dev,2007,53(2):369-380.

[16] Smith JT,Coolen LM,Kriegsfeld LJ,etal.Variation in kisspeptin and RFamide-related peptide (RFRP) expression and terminal connections to gonadotropin-releasing hormone neurons in the brain:a novel medium for seasonal breeding in the sheep[J].Endocrinology,2008,149(11):5770-5782.

[17] Han SK,Gottsch ML,Lee KJ,etal.Activation of gonadotropin-releasing hormone neurons by kisspeptin as a neuroendocrine switch for the onset of puberty[J].J Neuroscience,2005,25(49):11349-11356.

[18] Smith JT,Shahab M,Pereira A,etal.Hypothalamic expression of KISS1 and gonadotropin inhibitory hormone genes during the menstrual cycle of a non-human primate[J].Biol Reprod,2010,83(4):568-577.

[19] Kriegsfeld LJ,Mei DF,Bentley GE,etal.Identi cation and characterization of a gonadotropin-inhibitory system in the brains of mammals[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(7):2410-2415.

[20] Johnson MA,Fraley GS.Rat RFRP-3 alters hypothalamic GHRH expression and growth hormone secretion but does not affect KiSS-1 gene expression or the onset of puberty in male rats[J].Neuroendocrinology,2008,88(4):305-315.

[21] Sari IP,Rao A,Smith JT,etal.Effect of RF-amide related peptide-3 on LH and FSH synthesis and secretion in ovine pituitary gonadotropes[J].Endocrinology,2009,150(12):5549-5556.