劉春香，李洪濤，趙光強

（濰坊學院，山東 濰坊 261061）

蘿卜辣味與黑芥子酶＊

劉春香，李洪濤，趙光強

（濰坊學院，山東 濰坊 261061）

綜述了與蘿卜辣味有關的各種因素。介紹了辣味物質的化學成份、性質、種類、分布及影響辣味物質形成的環(huán)境因素；簡要描述了辣味物質的的合成途徑；辣味物質對植物自身的防御作用和其他功能以及對人體的生理功能；詳細介紹了黑芥子酶及其基因的研究現(xiàn)狀，并就黑芥子酶基因與蘿卜辣味的調控方面做了展望。

蘿卜；辣味；黑芥子酶

蘿卜（Raphanus sativus L）是一種重要的栽培蔬菜之一，種類繁多，青皮蘿卜不僅作為蔬菜，同時還可以代替水果生食，尤其是以品質著稱的濰縣蘿卜或水果蘿卜。生食蘿卜對品質的要求較高，辣味是蘿卜品質的重要指標之一。

1 蘿卜的辣味物質

蘿卜的辣味是由4-甲硫基－3－丁烯異硫氰酸鹽（4-Thylthio-3-Butenyl Isothiocyanate，MTB-ITC）引起的［1］。MTB-ITC為一種黃色油狀物，具揮發(fā)性，能溶于水、乙醇等有機溶劑，極不穩(wěn)定，在水溶液中無需酶的作用就很快分解，最后可生成黃色素［2－3］。MTB-ITC是一種硫代葡萄糖苷在黑芥子酶水解下的產(chǎn)物。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，又稱芥子油苷，簡稱硫苷），是一類與生氰葡糖苷相關聯(lián)的次生代謝物，廣泛存在于白花菜目十字花科蔬菜中，梧桐科、番木瓜科、大戟科等科中也有零星分布，在山苷科（Capparis spinosa中［4］極少存在。

硫苷本身是一種很穩(wěn)定的水溶性化合物，但在黑芥子酶作用下發(fā)生水解反應，異硫氰酸鹽（isothiocyanates，ITCs）是其最主要的降解產(chǎn)物，不同類型的ITC對應的前體物也不同［5］。自Ettlinger等1831年首次描述硫苷以來，迄今已經(jīng)有多種結構不同的硫苷被鑒定出來，這些硫苷的結構差異主要是由于其側鏈的R基團替換而造成的［6］。硫苷由磺酸肟（sulfonated oxime）、β-硫代葡糖（β-thio-glucose）和一個可變的側鏈（R）（side-chains）三部分構成，磺酸肟和β-硫代葡糖構成硫苷的主體，又稱為硫苷的核心部分，而不同類型的硫苷則帶有不同的R側鏈［7］。

根據(jù)R基團的不同可分為脂肪類、芳香類和吲哚類硫苷。到目前為止，從十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的硫代葡萄糖苷種類至少有120種，其中最常見的硫苷有烯丙基硫苷、苯乙基硫苷、苯甲基-4-甲硫丁基硫苷、3-甲基亞硫磺酰丙基硫苷、4-甲基亞硫磺丁基硫苷等［8］。MTB-ITC是蘿卜中的硫苷，也稱蘿卜硫素（glucoraphenin）。

芥子油苷的生物合成途徑已經(jīng)比較清楚，4-甲硫基-3-丁烯異硫氰酸鹽葡萄糖苷（MTB-GSL）的合成前體是氨基酸，合成過程可大致分為3個階段：氨基酸側鏈延長（鏈延長反應）、核心結構合成和次級修飾。氨基酸經(jīng)側鏈延長反應后由細胞色素P450（CYTP450）家族的CYTP79和NADPH催化轉變?yōu)橄鄳碾浚╫xmie），肟再經(jīng)過一系列的反應形成芥子油苷核心結構，核心結構的側鏈經(jīng)過各種修飾形成不同的芥子油苷。芥子油苷及其降解產(chǎn)物的理化性質很大程度上取決于側鏈結構。

2 辣味物質的生理作用

目前已普遍認可含硫有機化合物如ITC可作為植物預防病害的物質。對昆蟲及病原菌有防御作用。芥子酶與它共存，共同形成防御網(wǎng)絡硫苷－黑芥子酶系統(tǒng)（Glucosinolate-Myrosinase system），該系統(tǒng)還對植物的生長發(fā)育、次生代謝物的產(chǎn)生、生長素微調等都有著很重要的意義。在植物體內，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，而黑芥子酶分布在特定的黑芥子酶細胞中。在細胞內，黑芥子酶往往與黑芥子酶結合蛋白和黑芥子酶協(xié)助蛋白形成黑芥子酶復合體催化硫代葡萄糖苷的水解。當植物組織受到損傷時，硫代葡萄糖苷與黑芥子酶直接接觸，并使硫代葡萄糖苷水解為異硫氰酸、腈等有毒物質來保護自身免遭食草動物的傷害。其中的異硫氰酸對非專一性食草動物（generalist herbivore）和專一性（specialist herbivore）的食草動物都表現(xiàn)出較高的毒性，因此，硫苷－黑芥子酶系統(tǒng)被認為是植物與抵御取食有關的一個防御系統(tǒng)。硫苷的降解產(chǎn)物對很多真菌的菌絲都有明顯的毒性作用，還對一些細菌、線蟲有抑制和抵抗活性［9］。硫苷－黑芥子酶系統(tǒng)作為十字花科植物用以抵御昆蟲侵害的化學武器，對大多數(shù)昆蟲都產(chǎn)生毒性，但一些單食性、寡食性的害蟲已突破這種化學防御機制，成為其尋找寄主的信息化合物，已證實硫苷及其水解產(chǎn)物對小菜蛾（Plutella xylostella L）、菜粉蝶（Pieris rapae L）等害蟲的產(chǎn)卵與取食有引誘和刺激作用［10－11］。高澤正的研究表明黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata F）基本趨向選擇硫代葡萄糖苷含量較高的蔬菜［12］；喻國泉報道小菜蛾趨向選擇硫代葡萄糖苷含量較高的蔬菜上產(chǎn)卵［13］。

小菜蛾幼蟲體內的硫酸酯酶（sulfatase）可將芥子油苷裂解為既無毒性又不能被黑芥子酶降解的去硫芥子油苷［14］。菜粉蝶體內可形成NSP（nitrile-specifier protein），直接將芥子油苷降解為腈，從而減少毒性較大的ITC的形成量，并且通過糞便將腈排出體外［15］。有些昆蟲不僅可以避免芥子油苷降解，還可以利用芥子油苷形成自己的防御物質。甘藍蚜和蘿卜蚜可將攝取的芥子油苷轉移至晶狀微體（crystalline microbodies），與體內黑芥子酶區(qū)隔化（compartmentalization），避免產(chǎn)生毒性產(chǎn)物。當遭到病菌感染或天敵捕食后，晶狀微體的完整性被破壞，芥子油苷被黑芥子酶降解為ITC。ITC可直接殺死病菌或作為警報信息素（alarm pheromone）警示同類以逃避天敵［16－17］。

黑芥子酶同幾丁質酶等蛋白是從植物根中分泌出來的物質防御相關的蛋白，也是發(fā)育依賴性的蛋白，在開花時期表達量也升高，分析表明這些防御蛋白與植物的開花時間具有相關性［18］。

對于人體，MTB-ITC首先能作用于味覺神經(jīng)，引起辣味，同時也有抗菌消炎和鎮(zhèn)痛的作用，MTB-ITC對人體的不利影響是它能減少碘向甲狀腺的供給，促使甲狀腺腫大。蘿卜中的異硫氰酸鹽MTB-ITC是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)最強的抗癌成分［19］。ITC以阻遏和抑制致癌因子而發(fā)揮抗癌作用［20］。ITC作為阻遏因子通過與致癌代謝中的一些關鍵性靶位點發(fā)生反應來預防癌癥的發(fā)生，而抑制因子則在阻遏因子之后，通過抑制細胞分裂，誘導細胞程序性死亡來延遲和逆轉癌癥的發(fā)生。

3 辣味物質的定量分析及分布

有關辣味物質MTB-ITC在肉質根不同部位的分布，1991年Gensho做了研究，他認為在蘿卜皮（韌皮部）的含量大于蘿卜肉（木質部），蘿卜肉中，真根部的頂端含量最高，向根頭部的方向逐步減少，根頭部的內層木質部含量最少［21］。當蘿卜肉質根榨汁液中MTB-ITC含量低于100μmol／100m L時，辣味等級為0，多數(shù)人感覺不辣；MTB-ITC含量在100-200μmol／100m L時，辣味等級為1，多數(shù)人認為比較辣，但不影響生食；MTB-ITC含量達到200μmol／100m L或更高時，辣味平均等級則達到3以上，多數(shù)人認為辣味強烈，不適合生食。引起辣味的主要原因是由于氣候炎熱、干旱、肥水不足、病蟲害危害、肉質根未能充分肥大等因素，導致肉質根中辣味物質含量過高［22］。可見口感辣味等級越高，MTB-ITC的含量越高。這也驗證了MTB-ITC是蘿卜肉質根辣味的主要物質。因此辣味強弱的劃分除可用人的味覺感知外，還可以用MTB-ITC含量來表示。1966年Palle Friis用氣相色譜質譜聯(lián)用儀（GC-MS）的方法鑒定出蘿卜肉質根中存在MTB-GSL［1］。1985年Carlson［22］對109個分別來自美國、日本、韓國的蘿卜品種進行測定，發(fā)現(xiàn)其中根部MTB-ITC的含量在100-300μmol／100g鮮重。1990年Okano提出了MTB-ITC的快速測定法并研究表明MTB-ITC的含量與蘿卜肉質根辣味成正相關［23］。

4 環(huán)境對辣味物質形成的影響

蘿卜中的MTB-ITC含量不僅受遺傳、植物部位影響，還受環(huán)境因素的影響。劉光文提出辣味與生長期中30℃以上高溫積累有關［24］，劉長榮認為辣味加重和土壤缺水有關［25］，沈奇等認為溫度是影響MTBITC含量的主要因素，高溫有利于MTB-ITC的積累［21］。氣候對植物體內芥子油苷的組成也有影響明顯［26］。一般情況下，生長在熱帶地區(qū)的蕓苔屬作物（如油菜）種子中芥子油苷的組成成分與溫帶地區(qū)的有很大差異。印度次大陸的油菜籽中主要含有3-丁烯基芥子苷（3-butenyl glucosionlate）、2-丙烯基芥子油苷（2-propenyl glucosinolate）以及4-戊烯基芥子油苷（4-pentenylglucosinolate），而歐洲等溫帶地區(qū)的油菜籽中主要是3-丁烯基芥子油苷、2-羥基-3-丁烯基芥子油苷（2-hydroxy3-butenylglucosinolate）、4-羥基吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hrdroxyindol-3-ylmethylglucosinolate），卻不含4-戊烯基子油苷［27］。有色光明顯影響蕪箐根部的芥子油苷含量，其中藍光的影響最為強烈［28］，在連續(xù)單側藍光的照射下，蘿卜（Raphanus sativus）的黃化苗胚軸（etiolated hypocotyls）中4-甲硫-3-丁烯基芥子油苷（4-methylthio-3-butenyl glucosinolate）含量下降，其降解產(chǎn)物4-甲硫-3-丁烯基異硫代氰酸鹽（4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate）以及調節(jié)植物向光性的物質—蘿卜寧（raphanusanin）迅速積累。此外，單側藍光使胚軸中黑芥子酶活性明顯增加；相對于短日照，長日照可引起芥子油苷濃度大幅度增加。

5 黑芥子酶及黑芥子酶基因

黑芥子酶又稱黑芥子硫苷酸酶，是催化芥子油苷生成ITC的水解酶，它可以耐受較高的溫度和范圍較大的p H值，但是較高的鹽濃度對該酶的影響較大［29］。黑芥子酶存在于所有含芥子油苷植物的種子、根、莖和葉中。目前在分屬15個科500多種的雙子葉植物中均鑒定到黑芥子酶的存在，最近，Nong報道在番木瓜中也發(fā)現(xiàn)了黑芥子酶基因［30］。大量的組織學研究表明黑芥子酶存在于黑芥子酶細胞中，而黑芥子酶細胞定位于細胞原體，與蛋白體或液泡相結合。黑芥子酶在不同組織中表達不同，免疫化學分析表明，蘿卜的韌皮部是黑芥子酶活性最高的部位，木質部的黑芥子酶含量較少［31］。

對十字花科蔬菜中黑芥子酶的研究較多，已有不少十字花科蔬菜的黑芥子酶基因被克隆出來，擬南芥中克隆到了6個黑芥子酶基因（TGG1-TGG6），其中TGG4和TGG5是根中表達的黑芥子酶［29］。蘿卜等十字花科蔬菜中均已克隆到黑芥子酶基因，在擬南芥中還克隆到了與黑芥子酶合成相關的基因，對這些基因進行分析，可以為進一步進行硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)的研究提供基礎。根據(jù)親緣關系的遠近，蘿卜黑芥子酶基因與大白菜、菜心、芥菜、芥藍聚在一組。

植物中葡萄糖異硫氰酸鹽的含量和種類直接與黑芥子酶是相關的，在鹽水芹的種子中只含有脂肪族的ITC，而根、花和角果中卻含有芳香族、吲哚類等7種ITC，發(fā)育第四期的根中ITC含量最高而后下降與芥子酶活性相關［32］。

黑芥子酶是典型的植物糖基化酶，是ITC合成的關鍵酶。植物黑芥子酶是一個同源二聚體，結構與O-糖苷酶結構類似，不同之處主要在于活性中心基團的差異，在黑芥子酶活性位點上谷氨酸代替了O-糖苷酶的谷氨酰胺，昆蟲體內的黑芥子酶活性位點為谷氨酰胺［33］。實際上黑芥子酶很少以游離形式存在，它與一些輔酶如黑芥子酶結合蛋白（myrosinasebinding protein，MBP）、黑芥子酶協(xié)助蛋白（myrosinaseassociated protein，MAP）等形成復合物［6］。機械損傷、昆蟲取食、茉莉酸甲酯和脫落酸等因素能誘導MBP、MAP基因的轉錄，水楊酸則抑制其轉錄。在黑芥子酶的翻譯后修飾過程中，糖基化與去糖基化作用可調控酶的活性［34］。

6 展望

2000年Hara克隆了蘿卜黑芥子酶基因的cDNA［31］，采用黑芥子酶基因的序列，選擇該蛋白質的免疫活性較強的部位，構建基因工程的載體，獲得部分表達蛋白或含黑芥子酶序列在動物組織能表達的載體，免疫動物，獲得抗體，通過酶聯(lián)免疫方法能夠檢測到該酶的活性高低，可以利用這種間接參數(shù)大量檢測蘿卜樣品，用以表示肉質根辣味物質含量。

Brigit于2010年報道了一個有趣的實驗，采用黑芥子酶細胞專一性啟動子Myr1.Bn1連接一個被稱為barnase的核酸酶，轉化油菜，在這一核酸酶的作用下，細胞會死亡，不僅黑芥子細胞，其他細胞也受影響，為了僅消除黑芥子細胞，保存其他正常發(fā)育需要的細胞，研究者又在油菜內轉入了一個barnase核酸酶的抑制劑基因，利用了組成型的Ca MV35S啟動子，經(jīng)過這樣的處理，油菜的生長正常，黑芥子細胞被消除，油菜中再也沒有芥子油的辣味產(chǎn)生［35］。蘿卜在高溫等逆境下栽培會出現(xiàn)辣味過重的現(xiàn)象，那么油菜上的研究可否為研究者提供一點降低辣味的啟示呢？在低溫季節(jié)蘿卜栽培上遇到的問題是辣味過淡，顯得品質欠佳，如何平衡這一問題，是在酶的水平上調控還是在基因的水平上改變呢？黑芥子酶究竟在蘿卜辣味形成的過程中是不是限制性因素，這些都是有待研究的問題，也是指導生產(chǎn)的重要理論基礎。

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（責任編輯：肖恩忠）

The Piquancy of Radish and Myrosinase

LIU Chun－xiang，LI Hong－tao，ZHAO Guang－qiang
（Weifang University，Weifang 261061，China）

This paper reviewed some factors related to the puiquancy of radish.The chemical component，characters，varieties and of radish piquancy compounds were introduced，and also environmental factors effecting the formation of radish piquancy compounds were mentioned.The function of the puiquancy compounds include plant defences function and others，the physiological function for human were briefly summarized.The study of myrosinase and myrosinase gene were introduced in detail.We describe the prospect of myrosinase gene and the regulation of radish piquancy.

radish，piquancy，myrosinase

2011－05－16

山東省星火計劃項目（2010XH0620）；山東省教育廳項目（J09LC53）；濰坊市科技發(fā)展項目（201003038）

劉春香（1974－），女，黑龍江望奎人，濰坊學院生物工程學院副教授，博士。研究方向：蔬菜育種與分子生物學。

S631.1 文獻標識碼：A 文章編號：1671－4288（2011）06－0077－05